जाइगोट्स के सीआरआईएसपीआर इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा चूहों का कुशल जीनोम संपादन
Summary
यहां, हम आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की कुशल पीढ़ी के लिए एक सरल तकनीक का वर्णन करते हैं जिसे सीआरआईएसपीआर आरएनपी इलेक्ट्रोपोरेशन ऑफ जाइगोट्स (सीआरआईएसपीआर-ईजेड) कहा जाता है। यह विधि 100% तक पहुंचने वाली दक्षता पर भ्रूण में इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा संपादन अभिकर्मकों को वितरित करती है। यह प्रोटोकॉल स्तनधारी भ्रूण में बिंदु उत्परिवर्तन, छोटे जीनोमिक सम्मिलन और विलोपन के लिए प्रभावी है।
Abstract
असाधारण दक्षता, सटीकता और आसानी के साथ, CRISPR / Cas9 प्रणाली ने सेल संस्कृति और प्रयोगशाला पशु प्रयोगों में जीनोम संपादन में काफी सुधार किया है। पशु मॉडल उत्पन्न करते समय, युग्मनज का इलेक्ट्रोपोरेशन माइक्रोइंजेक्शन की स्वर्ण मानक विधि के विकल्प के रूप में उच्च दक्षता, सादगी, लागत और थ्रूपुट प्रदान करता है। इलेक्ट्रोपोरेशन भी उच्च व्यवहार्यता के साथ सौम्य है, और विश्वसनीय रूप से कैस 9 / एकल-गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) को सामान्य प्रयोगशाला माउस उपभेदों (जैसे, सी 57 बीएल / 6 जे और सी 57 बीएल / 6 एन) के युग्मकों में वितरित करता है जो 100% वितरण दक्षता तक पहुंचता है। यह तकनीक प्रविष्टि / विलोपन (इंडेल) उत्परिवर्तन, बिंदु उत्परिवर्तन, पूरे जीन या एक्सॉन के विलोपन, और 100-200 बीपी की सीमा में छोटे सम्मिलन को एलओएक्सपी या एफएजी, एचए या वी 5 जैसे छोटे टैग डालने में सक्षम बनाती है। लगातार सुधार करते हुए, यहां हम एक प्रोटोकॉल में सीआरआईएसपीआर-ईजेड की वर्तमान स्थिति को प्रस्तुत करते हैं जिसमें इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन, भ्रूण प्रसंस्करण, आरएनपी असेंबली, इलेक्ट्रोपोरेशन और प्रीइम्प्लांटेशन भ्रूण की जीनोटाइपिंग के माध्यम से एसजीआरएनए उत्पादन शामिल है। भ्रूण में हेरफेर करने के न्यूनतम अनुभव के साथ एक स्नातक स्तर का शोधकर्ता इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके 1 सप्ताह से भी कम समय में आनुवंशिक रूप से संपादित भ्रूण प्राप्त कर सकता है। यहां, हम एक सरल, कम लागत वाली, कुशल, उच्च क्षमता वाली विधि प्रदान करते हैं जिसका उपयोग माउस भ्रूण के साथ किया जा सकता है।
Introduction
जीवित चूहों में जीनोम संपादन काफी सरल हो गया है और सीआरआईएसपीआर संपादन 1,2,3 के उद्भव के बाद से सुलभ और अधिक किफायती हो गया है। प्रारंभिक पशु संपादन प्रयासों ने सीआरआईएसपीआर सीएएस 9 एमआरएनए / एसजीआरएनए को प्रोन्यूक्लियर-स्टेज भ्रूण 4,5,6 में वितरित करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग किया। जबकि माइक्रोइंजेक्शन काफी प्रभावी है, इसे पूरी तरह से मास्टर करने के लिए आवश्यक अभ्यास की मात्रा प्रशिक्षुओं और छात्रों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकती है और महंगे उपकरणों की भी आवश्यकता होती है जो एक मामूली वित्त पोषित प्रयोगशाला वहन करने में असमर्थ है। माइक्रोइंजेक्शन आमतौर पर ट्रांसजेनिक सुविधाओं में विशेषज्ञ तकनीशियनों द्वारा शेड्यूल और सेवा की कीमतों के साथ किया जाता है जो कई शोधकर्ताओं के लिए दर-सीमित हैं। एक अधिक सुलभ दृष्टिकोण इलेक्ट्रोपोरेशन का है, जिसे सीआरआईएसपीआर सीएएस 9 एमआरएनए / एसजीआरएनए के प्रोन्यूक्लियर-स्टेज भ्रूण7 में वितरण के लिए काफी प्रभावी दिखाया गया है। सीआरआईएसपीआर जीनोम संपादन और वितरण रणनीतियों में आगे के सुधारों ने सुझाव दिया कि पहले से ही एसजीआरएनए के साथ लगे हुए पूर्व-इकट्ठे आरएनएस मोज़ेकिज्म 8 को कम करने का एक प्रभावी साधन हो सकताहै।
इस प्रोटोकॉल के विकास और उपयोग के पीछे तर्क माइक्रोइंजेक्शन से जुड़ी कई सीमाओं और बाधाओं को बाईपास करना था। जैसा कि नाम से ही स्पष्ट है, एक आसान, इन-हाउस और लागत प्रभावी विधि जो जल्दी से यह निर्धारित कर सकती है कि माइक्रोइंजेक्शन प्रयोग के दौरान अप्रमाणित एसजीआरएनए डिजाइन उपयोग करने योग्य होंगे या नहीं, यह एक बहुत ही सुविधाजनक पहला पास गुणवत्ता नियंत्रण कदम होगा (चित्रा 1)। हालांकि यह विधि अधिक जटिल रणनीतियों के लिए माइक्रोइंजेक्शन को प्रतिस्थापित नहीं कर सकती है, जैसे पुनर्संयोजन-आधारित परिणामों के लिए लंबे दाता डीएनए अनुक्रमों को पेश करना, यह छोटे विलोपन या सम्मिलन और टैगिंग जीन जैसी कम जटिल रणनीतियों के लिए आदर्श है। यह विधि बुनियादी भ्रूण हेरफेर कौशल वाले शोधकर्ताओं के लिए उपयुक्त है, जिनके पास सरल संपादन आवश्यकताएं हैं, प्रीइंप्लांटेशन विकास की समय सीमा के भीतर अपनी परिकल्पना का परीक्षण करना चाहते हैं, या माइक्रोइंजेक्शन विशेषज्ञ के साथ नियुक्ति निर्धारित करने से पहले भ्रूण में एसजीआरएनए का परीक्षण करना पसंद करते हैं। यहां, संपादन अभिकर्मकों को मोज़ेकिज्म को कम करते हुए दक्षता को अधिकतम करने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन (विद्युत दालों की एक श्रृंखला) के माध्यम से कैस 9 / एसजीआरएनए आरएनपी के रूप में प्रोन्यूक्लियर-स्टेज भ्रूण में क्षणिक रूप से वितरितकिया जाता है। भ्रूण जीनोटाइपिंग विधि का उपयोग करके, संपादन परिणाम लगभग 1 सप्ताह9 में उपलब्ध होते हैं, इस प्रकार काफी कम लागत पर विभिन्न माइक्रोइंजेक्शन अनुप्रयोगों की आवश्यकता कम हो जाती है।
इस विधि की प्रभावशीलता प्रोन्यूक्लियर भ्रूण चरण में चरम पर होती है, जब भ्रूण ने अभी तक मातृ और पैतृक प्रोन्यूक्लियस को नहीं जोड़ा है या एस-चरण में प्रवेश नहीं किया है (चित्रा 2)। सुपरोव्यूलेशन का उपयोग युग्मनज की संख्या को अधिकतम करने के लिए किया जाता है लेकिन प्रोन्यूक्लियर युग्मकों और अनफर्टिलाइज्ड अंडे दोनों का उत्पादन करता है। समग्र दक्षता बढ़ाने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन से पहले स्वस्थ युग्मकों का भी पूर्व-चयन किया जा सकता है। चूंकि अन्य इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल ने समान चरण 7,10,11,12,13,14,15 को शामिल करने की आवश्यकता के बिना युग्मनकों को कुशलतापूर्वक संपादित किया है, इस प्रोटोकॉल का एक वैकल्पिक कदम ज़ोना पेलुसीडा (जेडपी) का मामूली क्षरण है। जेडपी एक ग्लाइकोप्रोटीन परत है जो शुक्राणु बंधन, एक्रोसोम प्रतिक्रिया और प्रोन्यूक्लियर-स्टेज भ्रूण के आसपास निषेचन में सहायता करती है। हमारे अनुभव में, हमने पाया कि जिला परिषद का एक सौम्य एसिड-आधारित क्षरण व्यवहार्यता पर केवल मामूली प्रभाव के साथ विश्वसनीय कैस 9 आरएनपी इलेक्ट्रोपोरेशन डिलीवरी प्रदान करता है।
हमने माउस उपभेदों में इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से 100% दक्षता तक की आरएनपी वितरण दर देखी है जो आमतौर पर सी 57बीएल / 6 जे और सी 57 बीएल / 6 एन9, 16 जैसे अनुसंधान में उपयोग की जाती हैं। स्वतंत्र समूहों ने 11,12,13,14,15,17 से अधिक क्षमता या मिलान करने वाली क्षमता के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित प्रक्रियाएं भी विकसित की हैं, जिसमें इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल चूहे 18,19, सुअर 20,21,22 और गाय 23 में अच्छी तरह से काम कर रहे हैं। , इसलिए हम सुझाव देते हैं कि पाठक उन स्थितियों को खोजने के लिए प्रोटोकॉल की तुलना करें जो उनकी प्रयोगात्मक और उपकरण आवश्यकताओं के अनुरूप हैं। यहां वर्णित प्रणाली सामान्य सामग्री और उपकरणों का उपयोग करती है, जिसमें केवल बुनियादी भ्रूण हेरफेर कौशल की आवश्यकता होती है। यह तकनीक संपादन रणनीतियों की एक श्रृंखला के लिए प्रभावी है, जिससे इस विधि को अनुसंधान समुदाय के लिए व्यापक रूप से सुलभ बनाया जा सकता है।
कुशल संपादन के लिए आदर्श छोटे गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) को डिजाइन करना आवश्यक है। हम माउस भ्रूण में सीधे प्रति लक्ष्य साइट पर दो से तीन एसजीआरएनए रणनीतियों की स्क्रीनिंग की सलाह देते हैं, खासकर यदि माउस लाइन पीढ़ी वांछित है। एक बार डिजाइन किए जाने के बाद, उच्च गुणवत्ता वाले एसजीआरएनए का उत्पादन करने के लिए इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन (आईवीटी) जैसे क्लोनिंग-मुक्त तरीकों की सिफारिश की जातीहै। आरएनपी और एसजीआरएनए को 30-50 संसाधित प्रोन्यूक्लियर-स्टेज भ्रूण के साथ मिलाया जाता है और पहले अस्थायी रूप से जेडपी और कोशिका झिल्ली को स्थिर करने के लिए विद्युत दालों की एक श्रृंखला के संपर्क में लाया जाता है, बाद में छिद्रों को खुला रखने और युग्मनज24 के माध्यम से आरएनपी को वैद्युतकणसंचलन करने के लिए। अनुकूलन के बाद, हमने पाया कि थोक भ्रूण (~ 50) के लिए 30 वी पर छह 3 एमएस दालें संपादन प्रभावशीलता और व्यवहार्यता के लिए इष्टतम थीं, जो अत्यधिक कुशल कैस 9 / एसजीआरएनए आरएनपी डिलीवरी 9,16,25 प्रदान करती हैं। अलग-अलग माउस मोरुला में संपादन घटनाओं की पुष्टि सीआरआईएसपीआर संपादन के लिए आम विभिन्न सत्यापन रणनीतियों का उपयोग करके की जा सकती है, जैसे कि प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता (आरएफएलपी), टी 7 एंडोन्यूक्लिज़ पाचन, और रुचि के क्षेत्र का सेंगर अनुक्रमण26।
वर्तमान विधि सरल संपादन योजनाओं (चित्रा 3) के लिए सबसे उपयुक्त है, जैसे सम्मिलन / विलोपन (इंडेल), एक्सॉन-आकार के विलोपन 500-2000 बीपी के क्रम पर, और बिंदु उत्परिवर्तन और सी- या एन-टर्मिनल टैग (जैसे, फ्लैग, एचए, या वी 5) 9,16,27 जैसे छोटे सम्मिलन का वितरण। फ्लोरोसेंट टैग या सशर्त एलील के बड़े सम्मिलन की तरह जटिल जीनोम संपादन की क्षमता अनिश्चित बनी हुई है और आगामी सुधारों का वर्तमान फोकस है।
इस विधि को आसानी से महारत हासिल है और इसका उपयोग 1 सप्ताह9 (चित्रा 1) में सुसंस्कृत माउस भ्रूण में एसजीआरएनए का जल्दी से परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। इस काम में प्रस्तुत एक छह-चरण प्रोटोकॉल है, जिसमें 1) एसजीआरएनए डिजाइन शामिल है; 2) एसजीआरएनए संश्लेषण; 3) सुपरोव्यूलेशन और संभोग; 4) भ्रूण संस्कृति, संग्रह और प्रसंस्करण; 5) आरएनपी असेंबली और इलेक्ट्रोपोरेशन; 6) भ्रूण संस्कृति और जीनोटाइपिंग। उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों के बारे में जानकारी प्रदान की गई है (सामग्री की तालिका)। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, टायरोसिनेस (टायर) लोकस 9,16 को संपादित करने के लिए अभिकर्मकों को पूरक तालिका 1 में शामिल किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत एक सरल और अत्यधिक कुशल माउस जीनोम संपादन तकनीक है। इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग 1-2 सप्ताह (चित्रा 1) में संशोधित भ्रूण उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है और 6 सप्ताह 9 के भीतर संपादि?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एजेएम ने मूल अवधारणा बनाई जिसने सीआरआईएसपीआर-ईजेड के विकास का नेतृत्व किया और आंकड़ों का उत्पादन किया। सी.के.डी. ने इस वर्तमान पांडुलिपि के लिए आंतरिक और प्रकाशित प्रोटोकॉल को संकलित और अनुकूलित किया। एजेएम एनआईएच (आर00एचडी096108) द्वारा समर्थित है।
Materials
| 0.1-cm-gap electroporation cuvette | Bio-Rad | cat. no. 1652089 | Electroporation |
| 26-G, 1/2-inch needle | BD | cat. no. 305111 | Superovulation |
| 3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice | JAX | cat. no. 000664 | Superovulation |
| 35-mm Tissue culture dish | Greiner Bio-One, | cat. no. 627-160 | Embryo Culture |
| 60-mm Tissue culture dish | Greiner Bio-One, | cat. no. 628-160 | Embryo Processing |
| 6x loading dye | Thermo Fisher Scientific | cat. no. R0611 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade | Sigma-Aldrich, | cat. no. T1788 | Embryo Processing |
| BSA, embryo culture grade | Sigma-Aldrich | cat. no. A3311 | Embryo Processing and Culture |
| Cas9 protein | Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS | cat. no. 1074181 | Electroporation |
| DNase I, RNase-free | New England BioLabs, | cat. no. M0303 | sgRNA Synthesis |
| DPBS(calcium and magnesium free) | Gibco | cat. no. 14190-144 | Embryo Processing |
| EcoRI | NEB | cat. no. R3101S | Genotyping |
| EDTA, anhydrous | Sigma-Aldrich | cat. no. EDS-100G | RNP Buffer |
| Ethanol | Koptec | cat. no. V1016 | sgRNA Synthesis |
| Gelatin (powder) type B, laboratory grade | Fisher, | cat. no. G7-500 | Lysis Buffer |
| Glycerol, molecular-biology grade | Fisher | cat. no. BP229 | RNP Buffer |
| Taq Polymerase | Promega | cat. no. M712 | Genotyping |
| HEPES, cell culture grade | Sigma-Aldrich | cat. no. H4034 | RNP Buffer |
| HinfI (10,000 U/mL) | NEB | cat. no. R0155S | Genotyping |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs, | cat. no. E2040 | sgRNA Synthesis |
| Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG) | Millipore | cat. no. 230734 | Superovulation |
| Hyaluronidase/M2 | Millipore | cat. no. MR-051-F | Embryo Processing |
| KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids) | Zenith Biotech | cat. no. ZEKS-050 | Embryo Culture |
| LE agarose, analytical grade | BioExpress | cat. no. E-3120-500 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| M2 medium | Zenith Biotech | cat. no. ZFM2-050 | Embryo Processing |
| Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2) | Sigma-Aldrich | cat. no. M8266 | RNP and Lysis Buffer |
| Mineral Oil | Millipore | cat. no. ES-005C | Embryo Culture |
| Nonidet P-40,substitute (NP-40) | Sigma-Aldrich | cat. no. 74385 | Lysis Buffer |
| Nuclease-free water, molecular-biology grade | Ambion | cat. no. AM9937 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping | Integrated DNA Technologies | custom orders | sgRNA Design |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | cat. no. 31985062 | Embryo Culture |
| High-fidelity DNA polymerase | New England BioLabs, | cat. no. M0530 | sgRNA Synthesis |
| Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl) | Sigma-Aldrich | cat. no. P9333 | RNP and Lysis Buffer |
| Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG) | ProspecBio | cat. no. HOR-272 | Superovulation |
| Proteinase K, molecular-biology grade | Fisher | cat. no. BP1700-100 | Lysis Buffer |
| RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube | VWR | cat. no. 20170-333 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| RNase-free eight-well PCR strip tubes | VWR | cat. no. 82006-606 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Magnetic purification beads | GE Healthcare | cat. no. 65152105050250 | sgRNA Synthesis |
| Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | cat. no. C4706 | RNP Buffer |
| Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade | Teknova | cat. no. T1085 | Lysis Buffer |
| Tween 20 molecular-biology grade | Sigma-Aldrich | cat. no. P7949-500 | Lysis Buffer |
References
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
- Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
- Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system. Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).
- Kaneko, T., et al. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
- Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Biologie du développement. 445 (2), 156-162 (2019).
- Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
- Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).
- Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).
- Tröder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), 0196891 (2018).
- Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Génétique. 200 (2), 423-430 (2015).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Biologie du développement. 418 (1), 1-9 (2016).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation. Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Remy, S., et al. Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation. Scientific Reports. 7, 16554 (2017).
- Tanihara, F., et al. Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation. Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).
- Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes. Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).
- Nishio, K., et al. Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos. Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).
- Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Frontiers in Genetics. 11, 570069 (2020).
- Escoffre, J. M., et al. What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues. Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Modzelewski, A. J., et al. A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development. Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).
- Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
- Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 14811 (2019).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. Journal of Visualized Experiments. (3), e185 (2007).
- Takahashi, G., et al. GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice. Scientific Reports. 5, 11406 (2015).
- Tu, Z., et al. Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos. Scientific Reports. 7, 42081 (2017).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16 (1), 87 (2015).
- Zhu, L., et al. Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes. BMC Genomics. 10, 47 (2009).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
- Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. Designing and generating a mouse model: frequently asked questions. Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).
- Nakajima, K., et al. Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system. Scientific Reports. 6, 34703 (2016).
- Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nature Methods. 12 (6), 479 (2015).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
