접합체의 CRISPR 전기천공에 의한 마우스의 효율적인 게놈 편집
Summary
여기에서는 CRISPR RNP 접합체 전기천공(CRISPR-EZ)이라고 하는 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 간단한 기술을 설명합니다. 이 방법은 100%에 가까운 효율로 배아에 전기천공을 통해 편집 시약을 전달합니다. 이 프로토콜은 포유류 배아의 점 돌연변이, 작은 게놈 삽입 및 결실에 효과적입니다.
Abstract
탁월한 효율성, 정확성 및 용이성을 갖춘 CRISPR/Cas9 시스템은 세포 배양 및 실험실 동물 실험에서 게놈 편집을 크게 개선했습니다. 동물 모델을 생성할 때 접합체의 전기천공은 미세 주입의 황금 표준 방법의 대안으로 더 높은 효율성, 단순성, 비용 및 처리량을 제공합니다. 전기천공은 또한 더 부드럽고 생존력이 높으며 Cas9/단일 가이드 RNA(sgRNA) 리보핵단백질(RNP)을 100% 전달 효율에 근접하는 일반적인 실험실 마우스 균주(예: C57BL/6J 및 C57BL/6N)의 접합체에 안정적으로 전달합니다. 이 기술은 삽입/결실(indels) 돌연변이, 점 돌연변이, 전체 유전자 또는 엑손의 결실, LoxP 또는 FLAG, HA 또는 V5와 같은 짧은 태그를 삽입하기 위해 100-200bp 범위의 작은 삽입을 가능하게 합니다. 지속적으로 개선되고 있는 한편, 여기에서는 시험관 내 전사, 배아 처리, RNP 조립, 전기천공 및 착상 전 배아의 유전형 분석을 통한 sgRNA 생산을 포함하는 프로토콜에서 CRISPR-EZ의 현재 상태를 제시합니다. 배아 조작 경험이 거의 없는 대학원 수준의 연구원은 이 프로토콜을 사용하여 1주일 이내에 유전자 편집 배아를 얻을 수 있습니다. 여기에서 우리는 마우스 배아와 함께 사용할 수 있는 간단하고 저렴하며 효율적인 고용량 방법을 제공합니다.
Introduction
살아있는 마우스에서의 게놈 편집은 상당히 단순화되었으며 CRISPR 편집 1,2,3의 출현 이후 접근 가능하고 저렴해졌습니다. 초기 동물 편집 시도는 CRISPR Cas9 mRNA/sgRNA를 핵단계 배아 4,5,6에 전달하기 위해 미세 주입을 사용했습니다. 미세 주입은 매우 효과적이지만 완전히 마스터하는 데 필요한 연습량은 연수생과 학생에게 적합하지 않을 수 있으며 적당한 자금 지원을 받는 실험실에서는 감당할 수 없는 값비싼 장비가 필요합니다. 미세 주사는 일반적으로 많은 연구자에게 속도 제한적인 일정과 서비스 가격으로 형질 전환 시설의 전문 기술자가 수행합니다. 보다 접근하기 쉬운 접근법은 CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA를 핵 단계 배아7로 전달하는 데 매우 효과적인 것으로 입증 된 전기 천공법입니다. CRISPR 게놈 편집 및 전달 전략의 추가 개선은 이미 sgRNA와 결합된 사전 조립된 RNP가모자이크주의를 감소시키는 효과적인 수단이 될 수 있음을 시사했습니다8.
이 프로토콜의 개발 및 사용의 근거는 미세 주입과 관련된 많은 한계와 장애물을 우회하는 것이 었습니다. 이름에서 알 수 있듯이 미세주입 실험 중에 테스트되지 않은 sgRNA 설계가 가치가 있는지 여부를 신속하게 결정할 수 있는 쉽고 비용 효율적인 사내 방법은 매우 편리한 1차 통과 품질 관리 단계가 될 것입니다(그림 1). 이 방법은 재조합 기반 결과를 위해 긴 기증자 DNA 서열을 도입하는 것과 같은 더 복잡한 전략에 대한 미세 주입을 대체할 수는 없지만 작은 결실 또는 삽입 및 유전자 태깅과 같은 덜 복잡한 전략에는 이상적입니다. 이 방법은 간단한 편집이 필요하거나, 착상 전 발달 기간 내에 가설을 테스트하거나, 미세 주입 전문가와 약속을 잡기 전에 배아에서 sgRNA를 테스트하는 것을 선호하는 기본적인 배아 조작 기술을 가진 연구자에게 적합합니다. 여기에서 편집 시약은 전기천공(일련의 전기 펄스)을 통해 Cas9/sgRNA RNP로 핵 단계 배아에 일시적으로 전달되어모자이크를 줄이면서 효율성을 극대화합니다8. 배아 유전형 분석 방법을 사용하면 약 1주일 만에 편집 결과를 얻을 수 있습니다.9 따라서 크게 절감된 비용으로 다양한 미세 주입 응용 분야의 필요성을 줄일 수 있습니다.
이 방법의 효과는 배아가 아직 모계와 부계 전핵을 융합하지 않았거나 S기에 진입하지 않은 전핵 배아 단계에서 최고조에 달합니다(그림 2). 과배란은 접합체의 수를 최대화하는 데 사용되지만 전핵 접합체와 수정되지 않은 난자를 모두 생성합니다. 건강한 접합체는 또한 전체 효율을 높이기 위해 전기 천공 전에 미리 선택할 수 있습니다. 다른 전기천공 프로토콜이 유사한 단계 7,10,11,12,13,14,15를 포함할 필요 없이 접합체를 효율적으로 편집함에 따라, 이 프로토콜의 선택적 단계는 조나 펠루시다(ZP)의 약간의 침식이다. ZP는 핵 단계 배아를 둘러싼 정자 결합, 선체 반응 및 수정을 돕는 당 단백질 층입니다. 우리의 경험에서, 우리는 ZP의 부드러운 산 기반 침식이 생존력에 미미한 영향으로 신뢰할 수있는 Cas9 RNP 전기 천공 전달을 제공한다는 것을 발견했습니다.
우리는 C57BL/6J 및 C57BL/6N 9,16과 같은 연구에서 일반적으로 사용되는 마우스 균주에서 전기천공을 통해 최대 100% 효율의 RNP 전달 속도를 관찰했습니다. 독립적 인 그룹은 또한 미세 주입 11,12,13,14,15,17보다 크거나 일치하는 효율을 가진 전기 천공 기반 절차를 개발했으며, 전기 천공 프로토콜은 쥐18,19, 돼지 20,21,22 및 소 23에서 잘 작동합니다. 따라서 독자는 프로토콜을 비교하여 실험 및 장비 요구 사항에 가장 적합한 조건을 찾는 것이 좋습니다. 여기에 설명 된 시스템은 일반적인 재료와 장비를 사용하므로 기본적인 배아 조작 기술 만 필요합니다. 이 기술은 다양한 편집 전략에 효과적이므로 연구 커뮤니티에서 이 방법에 광범위하게 액세스할 수 있습니다.
이상적인 소형 가이드 RNA(sgRNA)를 설계하는 것은 효율적인 편집을 위해 필수적입니다. 특히 마우스 라인 생성이 필요한 경우 마우스 배아에서 직접 표적 부위당 2-3개의 sgRNA 전략을 스크리닝하는 것이 좋습니다. 일단 설계되면 고품질 sgRNA를 생산하기 위해 체외 전사(IVT)와 같은 클로닝 없는 방법을 권장합니다3. RNP 및 sgRNA는 30-50개의 처리된 핵 단계 배아와 혼합되고 일련의 전기 펄스에 노출되어 먼저 ZP 및 세포막을 일시적으로 투과화하고, 후속 펄스는 기공을 열린 상태로 유지하고 접합체(24)를 통해 RNP를 전기영동합니다. 최적화 후, 우리는 벌크 배아(~50)에 대해 30V에서 6개의 3ms 펄스가 편집 효율성과 생존력에 최적이며 매우 효율적인 Cas9/sgRNA RNP 전달 9,16,25를 제공한다는 것을 발견했습니다. 개별 마우스 모룰라에서의 편집 이벤트는 제한 단편 길이 다형성 (RFLP), T7 엔도뉴클레아제 소화 및 관심 영역26의 Sanger 시퀀싱과 같은 CRISPR 편집에 공통적인 다양한 검증 전략을 사용하여 확인할 수 있습니다.
현재의 방법은 삽입/삭제(indels), 500-2000bp 정도의 엑손 크기 결실, 점 돌연변이 및 C- 또는 N-말단 태그(예: FLAG, HA 또는 V5)9,16,27과 같은 작은 삽입의 전달과 같은 간단한 편집 체계(그림 3)에 가장 적합합니다. 형광 태그 또는 조건부 대립 유전자의 대규모 삽입과 같은 복잡한 게놈 편집의 가능성은 여전히 불확실하며 향후 개선의 현재 초점입니다.
이 방법은 쉽게 마스터할 수 있으며1주일 만에 배양된 마우스 배아에서 sgRNA를 빠르게 테스트하는 데 사용할 수 있습니다9(그림 1). 이 연구에서는 1) sgRNA 디자인을 포함하는 6 단계 프로토콜이 제시됩니다. 2) sgRNA 합성; 3) 과배란 및 짝짓기; 4) 배아 배양, 수집 및 가공; 5) RNP 조립 및 전기 천공; 6) 배아 배양 및 유전형 분석. 사용 된 모든 재료에 대한 정보가 제공됩니다 (재료 표). 양성 대조군으로서, 티로시나제(Tyr) 유전자좌 9,16을 편집하는 시약이 보충 표 1에 포함되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 것은 간단하고 매우 효율적인 마우스 게놈 편집 기술입니다. 전기천공은 1-2주 내에 변형된 배아를 생성하는 데 사용할 수 있으며(그림 1)6주 이내에 편집된 마우스를 생산할 수 있습니다9. RNP 7,10,11,12,13,14,15,17,32를 제공하는 동시대에 개발된 전기천공 기반 프로토콜과 비교할 때<sup class="xre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.J.M.은 CRISPR-EZ의 개발로 이어진 독창적인 개념을 만들고 피규어를 제작했습니다. C.K.D.는 이 현재 원고에 대한 내부 및 출판된 프로토콜을 편집하고 조정했습니다. AJM은 NIH (R00HD096108)에 의해 지원됩니다.
Materials
| 0.1-cm-gap electroporation cuvette | Bio-Rad | cat. no. 1652089 | Electroporation |
| 26-G, 1/2-inch needle | BD | cat. no. 305111 | Superovulation |
| 3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice | JAX | cat. no. 000664 | Superovulation |
| 35-mm Tissue culture dish | Greiner Bio-One, | cat. no. 627-160 | Embryo Culture |
| 60-mm Tissue culture dish | Greiner Bio-One, | cat. no. 628-160 | Embryo Processing |
| 6x loading dye | Thermo Fisher Scientific | cat. no. R0611 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade | Sigma-Aldrich, | cat. no. T1788 | Embryo Processing |
| BSA, embryo culture grade | Sigma-Aldrich | cat. no. A3311 | Embryo Processing and Culture |
| Cas9 protein | Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS | cat. no. 1074181 | Electroporation |
| DNase I, RNase-free | New England BioLabs, | cat. no. M0303 | sgRNA Synthesis |
| DPBS(calcium and magnesium free) | Gibco | cat. no. 14190-144 | Embryo Processing |
| EcoRI | NEB | cat. no. R3101S | Genotyping |
| EDTA, anhydrous | Sigma-Aldrich | cat. no. EDS-100G | RNP Buffer |
| Ethanol | Koptec | cat. no. V1016 | sgRNA Synthesis |
| Gelatin (powder) type B, laboratory grade | Fisher, | cat. no. G7-500 | Lysis Buffer |
| Glycerol, molecular-biology grade | Fisher | cat. no. BP229 | RNP Buffer |
| Taq Polymerase | Promega | cat. no. M712 | Genotyping |
| HEPES, cell culture grade | Sigma-Aldrich | cat. no. H4034 | RNP Buffer |
| HinfI (10,000 U/mL) | NEB | cat. no. R0155S | Genotyping |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs, | cat. no. E2040 | sgRNA Synthesis |
| Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG) | Millipore | cat. no. 230734 | Superovulation |
| Hyaluronidase/M2 | Millipore | cat. no. MR-051-F | Embryo Processing |
| KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids) | Zenith Biotech | cat. no. ZEKS-050 | Embryo Culture |
| LE agarose, analytical grade | BioExpress | cat. no. E-3120-500 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| M2 medium | Zenith Biotech | cat. no. ZFM2-050 | Embryo Processing |
| Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2) | Sigma-Aldrich | cat. no. M8266 | RNP and Lysis Buffer |
| Mineral Oil | Millipore | cat. no. ES-005C | Embryo Culture |
| Nonidet P-40,substitute (NP-40) | Sigma-Aldrich | cat. no. 74385 | Lysis Buffer |
| Nuclease-free water, molecular-biology grade | Ambion | cat. no. AM9937 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping | Integrated DNA Technologies | custom orders | sgRNA Design |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | cat. no. 31985062 | Embryo Culture |
| High-fidelity DNA polymerase | New England BioLabs, | cat. no. M0530 | sgRNA Synthesis |
| Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl) | Sigma-Aldrich | cat. no. P9333 | RNP and Lysis Buffer |
| Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG) | ProspecBio | cat. no. HOR-272 | Superovulation |
| Proteinase K, molecular-biology grade | Fisher | cat. no. BP1700-100 | Lysis Buffer |
| RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube | VWR | cat. no. 20170-333 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| RNase-free eight-well PCR strip tubes | VWR | cat. no. 82006-606 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Magnetic purification beads | GE Healthcare | cat. no. 65152105050250 | sgRNA Synthesis |
| Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | cat. no. C4706 | RNP Buffer |
| Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade | Teknova | cat. no. T1085 | Lysis Buffer |
| Tween 20 molecular-biology grade | Sigma-Aldrich | cat. no. P7949-500 | Lysis Buffer |
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