Effektiv genomredigering av mus ved CRISPR-elektroporering av zygoter

Summary

Her beskriver vi en enkel teknikk beregnet på effektiv generering av genmodifiserte mus kalt CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Denne metoden leverer redigeringsreagenser ved elektroporering til embryoer med en effektivitet som nærmer seg 100%. Denne protokollen er effektiv for punktmutasjoner, små genomiske innsettinger og delesjoner i pattedyrembryoer.

Abstract

Med eksepsjonell effektivitet, nøyaktighet og letthet har CRISPR / Cas9-systemet betydelig forbedret genomredigering i cellekultur og laboratorieforsøk. Ved generering av dyremodeller gir elektroporering av zygoter høyere effektivitet, enkelhet, kostnad og gjennomstrømning som et alternativ til gullstandardmetoden for mikroinjeksjon. Elektroporering er også mildere, med høyere levedyktighet, og leverer pålitelig Cas9 / single-guide RNA (sgRNA) ribonukleoproteiner (RNP) inn i zygotene til vanlige laboratoriemusestammer (f.eks. C57BL / 6J og C57BL / 6N) som nærmer seg 100% leveringseffektivitet. Denne teknikken muliggjør innsetting / sletting (indels) mutasjoner, punktmutasjoner, sletting av hele gener eller eksoner, og små innsettinger i området 100-200 bp for å sette inn LoxP eller korte koder som FLAG, HA eller V5. Mens vi stadig forbedres, presenterer vi her den nåværende tilstanden til CRISPR-EZ i en protokoll som inkluderer sgRNA-produksjon gjennom de vitro-transkripsjon, embryobehandling, RNP-montering, elektroporering og genotyping av preimplantasjonsembryoer. En forsker på høyere nivå med minimal erfaring med å manipulere embryoer kan få genetisk redigerte embryoer på mindre enn 1 uke ved hjelp av denne protokollen. Her tilbyr vi en enkel, billig, effektiv, høykapasitetsmetode som kan brukes med museembryoer.

Introduction

Genomredigering i levende mus har blitt betydelig forenklet og har blitt tilgjengelig og rimeligere siden fremveksten av CRISPR-redigering ^1,2,3. Innledende dyreredigeringsforsøk brukte mikroinjeksjon for å levere CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA til embryoer i pronukleære stadier ^4,5,6. Mens mikroinjeksjon er ganske effektiv, kan mengden praksis som kreves for å mestre det, ikke være hensiktsmessig for praktikanter og studenter, og krever også dyrt utstyr som et beskjedent finansiert laboratorium ikke har råd til. Mikroinjeksjon utføres normalt av ekspertteknikere ved transgene anlegg med tidsplaner og servicepriser som er hastighetsbegrensende for mange forskere. En mer tilgjengelig tilnærming er elektroporering, som har vist seg å være ganske effektiv for levering av CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA til pronukleære embryoer⁷. Ytterligere forbedringer i CRISPR-genomredigerings- og leveringsstrategier antydet at forhåndsmonterte RNP-er som allerede er engasjert med sgRNA, kan være et effektivt middel for å redusere mosaikk⁸.

Begrunnelsen for utviklingen og bruken av denne protokollen var å omgå mange av begrensningene og hindringene forbundet med mikroinjeksjon. Som navnet antyder, vil en enkel, intern og kostnadseffektiv metode som raskt kan avgjøre om uprøvde sgRNA-design vil være verdt å bruke under et mikroinjeksjonseksperiment, være et veldig praktisk kvalitetskontrolltrinn i første pass (figur 1). Selv om denne metoden ikke kan erstatte mikroinjeksjon for mer komplekse strategier, som å introdusere lange donor-DNA-sekvenser for rekombinasjonsbaserte resultater, er den ideell for mindre komplekse strategier som små delesjoner eller innsettinger og merking av gener. Denne metoden er egnet for forskere med grunnleggende embryomanipulasjonsferdigheter som har enkle redigeringsbehov, ønsker å teste hypotesen sin innen tidsrammen for preimplantasjonsutvikling, eller foretrekker å teste sgRNA i embryoer før de planlegger en avtale med en mikroinjeksjonsspesialist. Her blir redigeringsreagenser forbigående levert inn i embryoer i pronukleære stadier som Cas9 / sgRNA RNP via elektroporering (en serie elektriske pulser) for å maksimere effektiviteten samtidig som mosaikken reduseres⁸. Ved hjelp av en embryogenotypingsmetode er redigeringsresultater tilgjengelige etter ca. 1 uke⁹, og reduserer dermed behovet for ulike mikroinjeksjonsapplikasjoner til en betydelig redusert kostnad.

Denne metodens effektivitet topper seg på det pronukleære embryostadiet, når embryoet ennå ikke har smeltet sammen mors og fars pronuclei eller gått inn i S-fase (figur 2). Superovulasjon brukes til å maksimere antall zygoter, men produserer både pronukleære zygoter og ubefruktede egg. Sunn zygoter kan også forhåndsvelges før elektroporering for å øke den totale effektiviteten. Siden andre elektroporasjonsprotokoller effektivt har redigert zygoter uten å måtte inkludere et lignende trinn 7,10,11,12,13,14,15^, er et valgfritt trinn i denne protokollen den svake erosjonen av zona pellucida (ZP). ZP er et glykoproteinlag som hjelper spermatozoabinding, akrosomrespons og befruktning rundt embryoer i pronukleære stadier. Etter vår erfaring fant vi ut at en mild syrebasert erosjon av ZP gir pålitelig Cas9 RNP-elektroporasjonslevering med bare en marginal innvirkning på levedyktigheten.

Vi har observert RNP-leveringshastigheter på opptil 100% effektivitet via elektroporering i musestammer som ofte brukes i forskning som C57BL / 6J og C57BL / 6N ^9,16. Uavhengige grupper har også utviklet elektroporasjonsbaserte prosedyrer med effektivitet større enn eller matchende mikroinjeksjon 11,12,13,14,15,17, med elektroporasjonsprotokoller som fungerer godt hos rotte^18,19, gris 20,21,22 og ku ²³ , så vi foreslår at leserne sammenligner protokollene for å finne forholdene som best passer deres eksperimentelle og utstyrsbehov. Systemet beskrevet her bruker vanlige materialer og utstyr, og krever bare grunnleggende embryomanipulasjonsferdigheter. Denne teknikken er effektiv for en rekke redigeringsstrategier, noe som gjør denne metoden bredt tilgjengelig for forskersamfunnet.

Å designe ideelle små guide-RNA (sgRNA) er avgjørende for effektiv redigering. Vi anbefaler screening to til tre sgRNA-strategier per målsted direkte i museembryoer, spesielt hvis muselinjegenerering er ønsket. Når de er designet, anbefales kloningsfrie metoder som in vitro-transkripsjon (IVT) for å produsere sgRNA av høy kvalitet³. RNPene og sgRNAene blandes med 30-50 behandlede pronukleære embryoer og utsettes for en serie elektriske pulser for først midlertidig å permeabilisere ZP og cellemembranen, med påfølgende pulser for å holde porene åpne og elektroforese RNPene gjennom zygote²⁴. Etter optimalisering fant vi ut at seks 3 ms pulser ved 30 V for bulkembryoer (~ 50) var optimale for redigeringseffektivitet og levedyktighet, og ga svært effektiv Cas9 / sgRNA RNP-levering ^9,16,25. Redigering av hendelser i individuelle musemorula kan bekreftes ved hjelp av en rekke valideringsstrategier som er vanlige for CRISPR-redigering, for eksempel restriksjonsfragmentlengdepolymorfisme (RFLP), T7 endonukleasefordøyelse og Sanger-sekvensering av interesseområdet²⁶.

Den nåværende metoden er mest hensiktsmessig for enkle redigeringsskjemaer (figur 3), for eksempel innsetting / slettinger (indels), eksonstore slettinger i størrelsesorden 500-2000 bp, og levering av punktmutasjoner og små innsettinger som C- eller N-terminalkoder (f.eks. FLAG, HA eller V5) ^9,16,27. Potensialet for kompleks genomredigering, som store innsettinger av fluorescerende koder eller betingede alleler, er fortsatt usikkert og er det nåværende fokuset for kommende forbedringer.

Denne metoden er lett å mestre og kan brukes til raskt å teste sgRNA i dyrkede museembryoer i 1 uke⁹ (figur 1). Presentert i dette arbeidet er en seks-trinns protokoll, som inkluderer 1) sgRNA-design; 2) sgRNA-syntese; 3) superovulasjon og parring; 4) embryokultur, innsamling og behandling; 5) RNP-montering og elektroporering; 6) embryokultur og genotyping. Informasjon om alle materialene som brukes er gitt (Materialfortegnelse). Som en positiv kontroll er reagenser for å redigere tyrosinase (Tyr) locus ^9,16 inkludert i tilleggstabell 1.

Protocol

All dyrepleie og bruk i hele denne protokollen fulgte retningslinjene for dyrevelferdsloven, ILAR Guide for Care and Use of Laboratory Animals og fulgte retningslinjene fra AVMA for eutanasi og University of Pennsylvania Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) retningslinjer og retningslinjer. Dyrepleie- og bruksprotokollen ble gjennomgått og godkjent av University of Pennsylvania IACUC for dette prosjektet. Som et spørsmål om overholdelse og forsiktighet, vennligst søk alle nødvendige autorisasjoner fø…

Representative Results

Denne metoden genererer mer enn 100 μg sgRNA (20 μL ved >6,000 ng / L-konsentrasjon) for effektiv Cas9 / sgRNA RNP-montering. Den rutinemessige superovulasjonsmetoden beskrevet her produserer vanligvis 10-20 levedyktige embryoer per plugget kvinne. På grunn av håndteringsfeil og typiske tap forbundet med embryomanipulasjon, er en forventet 80% av embryoene befruktet, levedyktig og i utmerket stand etter elektroporering. For å hjelpe forskere med å utføre et vellykket eksperiment, har vi gitt et eksempel på strate…

Discussion

Presentert her er en enkel og svært effektiv musegenomredigeringsteknologi. Elektroporering kan brukes til å generere modifiserte embryoer i løpet av 1-2 uker (figur 1) og kan produsere redigerte mus innen 6 uker⁹. Sammenlignet med samtidig utviklede elektroporasjonsbaserte protokoller som leverer RNP 7,10,11,12,13,14,15,17,32, er metoden som beskrevet her konseptuelt lik og gir effektivitet i samme område^</sup…

Materials

0.1-cm-gap electroporation cuvette	Bio-Rad	cat. no. 1652089	Electroporation
26-G, 1/2-inch needle	BD	cat. no. 305111	Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice	JAX	cat. no. 000664	Superovulation
35-mm Tissue culture dish	Greiner Bio-One,	cat. no. 627-160	Embryo Culture
60-mm Tissue culture dish	Greiner Bio-One,	cat. no. 628-160	Embryo Processing
6x loading dye	Thermo Fisher Scientific	cat. no. R0611	sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade	Sigma-Aldrich,	cat. no. T1788	Embryo Processing
BSA, embryo culture grade	Sigma-Aldrich	cat. no. A3311	Embryo Processing and Culture
Cas9 protein	Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS	cat. no. 1074181	Electroporation
DNase I, RNase-free	New England BioLabs,	cat. no. M0303	sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free)	Gibco	cat. no. 14190-144	Embryo Processing
EcoRI	NEB	cat. no. R3101S	Genotyping
EDTA, anhydrous	Sigma-Aldrich	cat. no. EDS-100G	RNP Buffer
Ethanol	Koptec	cat. no. V1016	sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory grade	Fisher,	cat. no. G7-500	Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology grade	Fisher	cat. no. BP229	RNP Buffer
Taq Polymerase	Promega	cat. no. M712	Genotyping
HEPES, cell culture grade	Sigma-Aldrich	cat. no. H4034	RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL)	NEB	cat. no. R0155S	Genotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	New England BioLabs,	cat. no. E2040	sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG)	Millipore	cat. no. 230734	Superovulation
Hyaluronidase/M2	Millipore	cat. no. MR-051-F	Embryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids)	Zenith Biotech	cat. no. ZEKS-050	Embryo Culture
LE agarose, analytical grade	BioExpress	cat. no. E-3120-500	sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 medium	Zenith Biotech	cat. no. ZFM2-050	Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2)	Sigma-Aldrich	cat. no. M8266	RNP and Lysis Buffer
Mineral Oil	Millipore	cat. no. ES-005C	Embryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40)	Sigma-Aldrich	cat. no. 74385	Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology grade	Ambion	cat. no. AM9937	sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping	Integrated DNA Technologies	custom orders	sgRNA Design
Reduced serum medium	Thermo Fisher Scientific	cat. no. 31985062	Embryo Culture
High-fidelity DNA polymerase	New England BioLabs,	cat. no. M0530	sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl)	Sigma-Aldrich	cat. no. P9333	RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG)	ProspecBio	cat. no. HOR-272	Superovulation
Proteinase K, molecular-biology grade	Fisher	cat. no. BP1700-100	Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube	VWR	cat. no. 20170-333	sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubes	VWR	cat. no. 82006-606	sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beads	GE Healthcare	cat. no. 65152105050250	sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)	Sigma-Aldrich	cat. no. C4706	RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade	Teknova	cat. no. T1085	Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology grade	Sigma-Aldrich	cat. no. P7949-500	Lysis Buffer