Zigotların CRISPR Elektroporasyonu ile Farelerin Verimli Genom Düzenlemesi
Summary
Burada, CRISPR RNP Zygotes Elektroporasyonu (CRISPR-EZ) adı verilen genetiği değiştirilmiş farelerin verimli bir şekilde üretilmesi için tasarlanmış basit bir tekniği açıklıyoruz. Bu yöntem, elektroporasyon yoluyla düzenleme reaktiflerini embriyolara %100’e yaklaşan bir verimlilikle teslim eder. Bu protokol, memeli embriyolarındaki nokta mutasyonları, küçük genomik eklemeler ve delesyonlar için etkilidir.
Abstract
Olağanüstü verimlilik, doğruluk ve kolaylık ile CRISPR / Cas9 sistemi, hücre kültüründe ve laboratuar hayvanı deneylerinde genom düzenlemeyi önemli ölçüde geliştirdi. Hayvan modelleri üretilirken, zigotların elektroporasyonu, altın standart mikroenjeksiyon yöntemine alternatif olarak daha yüksek verimlilik, basitlik, maliyet ve verim sunar. Elektroporasyon aynı zamanda daha yumuşaktır, daha yüksek canlılığa sahiptir ve Cas9 / tek kılavuzlu RNA (sgRNA) ribonükleoproteinlerini (RNP’ler) % 100 teslimat verimliliğine yaklaşan yaygın laboratuvar fare suşlarının (örneğin, C57BL / 6J ve C57BL / 6N) zigotlarına güvenilir bir şekilde iletir. Bu teknik, LoxP veya FLAG, HA veya V5 gibi kısa etiketler eklemek için ekleme / delesyon (indels) mutasyonları, nokta mutasyonları, tüm genlerin veya ekzonların silinmesi ve 100-200 bp aralığında küçük eklemeler yapılmasını sağlar. Sürekli olarak geliştirilirken, burada CRISPR-EZ’nin mevcut durumunu, in vitro transkripsiyon, embriyo işleme, RNP montajı, elektroporasyon ve preimplantasyon embriyolarının genotiplemesi yoluyla sgRNA üretimini içeren bir protokolde sunuyoruz. Embriyoları manipüle etme konusunda minimum deneyime sahip yüksek lisans düzeyinde bir araştırmacı, bu protokolü kullanarak genetik olarak düzenlenmiş embriyoları 1 haftadan daha kısa sürede elde edebilir. Burada, fare embriyolarıyla kullanılabilecek basit, düşük maliyetli, verimli, yüksek kapasiteli bir yöntem sunuyoruz.
Introduction
Canlı farelerde genom düzenleme önemli ölçüde basitleştirilmiştir ve CRISPR düzenlemesinin ortaya çıkmasından bu yana erişilebilir ve daha uygun fiyatlı hale gelmiştir 1,2,3. İlk hayvan düzenleme girişimleri, CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA’yı pronükleer evre embriyolara 4,5,6 vermek için mikroenjeksiyon kullandı. Mikroenjeksiyon oldukça etkili olsa da, tam olarak ustalaşmak için gereken uygulama miktarı kursiyerler ve öğrenciler için uygun olmayabilir ve ayrıca mütevazı bir şekilde finanse edilen bir laboratuvarın karşılayamayacağı pahalı ekipman gerektirir. Mikroenjeksiyon normalde transgenik tesislerde uzman teknisyenler tarafından, birçok araştırmacı için hız sınırlayıcı olan programlar ve hizmet fiyatları ile gerçekleştirilir. Daha erişilebilir bir yaklaşım, CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA’nın pronükleer evre embriyolara verilmesi için oldukça etkili olduğu gösterilen elektroporasyondur7. CRISPR genom düzenleme ve dağıtım stratejilerindeki daha fazla gelişme, halihazırda sgRNA’larla meşgul olan önceden monte edilmiş RNP’lerin mozaikliği azaltmak için etkili bir araç olabileceğini düşündürmektedir8.
Bu protokolün geliştirilmesinin ve kullanılmasının ardındaki mantık, mikroenjeksiyonla ilişkili sınırlamaların ve engellerin çoğunu atlamaktı. Adından da anlaşılacağı gibi, test edilmemiş sgRNA tasarımlarının bir mikroenjeksiyon deneyi sırasında kullanılmaya değer olup olmayacağını hızlı bir şekilde belirleyebilecek kolay, şirket içi ve uygun maliyetli bir yöntem, çok uygun bir ilk geçiş kalite kontrol adımı olacaktır (Şekil 1). Bu yöntem, rekombinasyon tabanlı sonuçlar için uzun donör DNA dizileri tanıtmak gibi daha karmaşık stratejiler için mikroenjeksiyonun yerini alamazken, küçük silmeler veya eklemeler ve etiketleme genleri gibi daha az karmaşık stratejiler için idealdir. Bu yöntem, basit düzenleme ihtiyaçları olan, hipotezlerini preimplantasyon geliştirme süresi içinde test etmek isteyen veya bir mikroenjeksiyon uzmanıyla randevu almadan önce embriyolardaki sgRNA’ları test etmeyi tercih eden temel embriyo manipülasyon becerilerine sahip araştırmacılar için uygundur. Burada, düzenleme reaktifleri, mozaisizmi azaltırken verimliliği en üst düzeye çıkarmak için elektroporasyon (bir dizi elektrik darbesi) yoluyla Cas9 / sgRNA RNP’ler olarak pronükleer aşamadaki embriyolara geçici olarak verilir8. Bir embriyo genotipleme yöntemi kullanılarak, düzenleme sonuçları yaklaşık 1 hafta9’da elde edilebilir, böylece çeşitli mikroenjeksiyon uygulamalarına olan ihtiyaç önemli ölçüde azaltılmış bir maliyetle azalır.
Bu yöntemin etkinliği, embriyonun henüz anne ve baba pronükleisini kaynaştırmadığı veya S-fazına girmediği pronükleer embriyo aşamasında zirveye ulaşır (Şekil 2). Süperovülasyon, zigot sayısını en üst düzeye çıkarmak için kullanılır, ancak hem pronükleer zigotlar hem de döllenmemiş yumurtalar üretir. Sağlıklı zigotlar, genel verimliliği artırmak için elektroporasyondan önce önceden seçilebilir. Diğer elektroporasyon protokolleri, benzer bir adım 7,10,11,12,13,14,15’i eklemeye gerek kalmadan zigotları verimli bir şekilde düzenlediğinden, bu protokolün isteğe bağlı bir adımı, zona pellucida’nın (ZP) hafif erozyonudur. ZP, pronükleer evre embriyoları çevreleyen spermatozoa bağlanmasına, akrozom yanıtına ve döllenmeye yardımcı olan bir glikoprotein tabakasıdır. Deneyimlerimize göre, ZP’nin hafif asit bazlı erozyonunun, canlılık üzerinde sadece marjinal bir etki ile güvenilir Cas9 RNP elektroporasyon dağıtımı sağladığını gördük.
C57BL / 6J ve C57BL / 6N 9,16 gibi araştırmalarda yaygın olarak kullanılan fare suşlarında elektroporasyon yoluyla% 100’e varan RNP dağıtım oranlarını gözlemledik. Bağımsız gruplar ayrıca, mikroenjeksiyon 11,12,13,14,15,17’den daha büyük veya eşleşen verimliliklere sahip elektroporasyon tabanlı prosedürler geliştirmiştir; elektroporasyon protokolleri sıçan 18,19, domuz20,21,22 ve 23’te iyi çalışmaktadır. Bu nedenle, okuyucuların deney ve ekipman ihtiyaçlarına en uygun koşulları bulmak için protokolleri karşılaştırmalarını öneririz. Burada açıklanan sistem, sadece temel embriyo manipülasyon becerileri gerektiren ortak malzemeler ve ekipmanlar kullanmaktadır. Bu teknik, bir dizi düzenleme stratejisi için etkilidir ve bu yöntemi araştırma topluluğu için geniş çapta erişilebilir kılar.
İdeal küçük kılavuz RNA’ların (sgRNA’lar) tasarlanması, verimli düzenleme için çok önemlidir. Hedef bölge başına iki ila üç sgRNA stratejisinin doğrudan fare embriyolarında, özellikle fare çizgisi üretimi isteniyorsa taranmasını öneririz. Bir kez tasarlandıktan sonra, yüksek kaliteli sgRNA’lar üretmek için in vitro transkripsiyon (IVT) gibi klonlamasız yöntemler önerilir3. RNP’ler ve sgRNA’lar 30-50 işlenmiş pronükleer aşama embriyosu ile karıştırılır ve önce ZP’yi ve hücre zarını geçici olarak geçirgenleştirmek için bir dizi elektrik darbesine maruz bırakılır, ardından gözenekleri açık tutmak için darbeler ve zigot24 yoluyla RNP’leri elektroforez eder. Optimizasyondan sonra, dökme embriyolar için 30 V’ta altı adet 3 ms darbenin (~ 50) etkinlik ve canlılığı düzenlemek için en uygun olduğunu ve yüksek verimli Cas9 / sgRNA RNP dağıtımı 9,16,25 sağladığını bulduk. Tek tek fare morulasındaki düzenleme olayları, kısıtlama fragman uzunluğu polimorfizmi (RFLP), T7 endonükleaz sindirimi ve ilgilenilen bölgenin Sanger dizilimi gibi CRISPR düzenlemesi için yaygın olan çeşitli doğrulama stratejileri kullanılarak doğrulanabilir26.
Mevcut yöntem, ekleme/silme (indels), 500-2000 bp mertebesinde ekzon boyutlu silmeler ve nokta mutasyonlarının ve C- veya N-Terminal etiketleri (örneğin, FLAG, HA veya V5) gibi küçük eklemelerin teslimi gibi basit düzenleme şemaları (Şekil 3) için en uygun yöntemdir9,16,27. Büyük floresan etiketlerin veya koşullu alellerin eklenmesi gibi karmaşık genom düzenleme potansiyeli belirsizliğini korumaktadır ve yaklaşmakta olan gelişmelerin şu anki odak noktasıdır.
Bu yönteme kolayca hakim olunur ve kültürlenmiş fare embriyolarındaki sgRNA’ları 1 hafta9’da hızlı bir şekilde test etmek için kullanılabilir (Şekil 1). Bu çalışmada sunulan, 1) sgRNA tasarımını içeren altı adımlı bir protokoldür; 2) sgRNA sentezi; 3) süperovülasyon ve çiftleşme; 4) embriyo kültürü, toplanması ve işlenmesi; 5) RNP montajı ve elektroporasyon; 6) embriyo kültürü ve genotipleme. Kullanılan tüm malzemeler hakkında bilgi verilmektedir (Malzeme Tablosu). Pozitif bir kontrol olarak, Tyrosinase (Tyr) lokusu 9,16’yı düzenleyen reaktifler Ek Tablo 1’e dahil edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada basit ve son derece verimli bir fare genomu düzenleme teknolojisi sunulmaktadır. Elektroporasyon, 1-2 hafta içinde modifiye embriyolar üretmek için kullanılabilir (Şekil 1) ve 6 hafta içinde düzenlenmiş fareler üretebilir9. RNP’leri 7,10,11,12,13,14,15,17,32 sağlayan eşzamanlı olarak geliştirilmiş elektroporasyon tabanlı </s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.J.M., CRISPR-EZ’in geliştirilmesine yol açan orijinal konsepti yarattı ve figürleri üretti. C.K.D. bu güncel makale için dahili ve yayınlanmış protokolleri derlemiş ve uyarlamıştır. A.J.M. NIH (R00HD096108) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 0.1-cm-gap electroporation cuvette | Bio-Rad | cat. no. 1652089 | Electroporation |
| 26-G, 1/2-inch needle | BD | cat. no. 305111 | Superovulation |
| 3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice | JAX | cat. no. 000664 | Superovulation |
| 35-mm Tissue culture dish | Greiner Bio-One, | cat. no. 627-160 | Embryo Culture |
| 60-mm Tissue culture dish | Greiner Bio-One, | cat. no. 628-160 | Embryo Processing |
| 6x loading dye | Thermo Fisher Scientific | cat. no. R0611 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade | Sigma-Aldrich, | cat. no. T1788 | Embryo Processing |
| BSA, embryo culture grade | Sigma-Aldrich | cat. no. A3311 | Embryo Processing and Culture |
| Cas9 protein | Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS | cat. no. 1074181 | Electroporation |
| DNase I, RNase-free | New England BioLabs, | cat. no. M0303 | sgRNA Synthesis |
| DPBS(calcium and magnesium free) | Gibco | cat. no. 14190-144 | Embryo Processing |
| EcoRI | NEB | cat. no. R3101S | Genotyping |
| EDTA, anhydrous | Sigma-Aldrich | cat. no. EDS-100G | RNP Buffer |
| Ethanol | Koptec | cat. no. V1016 | sgRNA Synthesis |
| Gelatin (powder) type B, laboratory grade | Fisher, | cat. no. G7-500 | Lysis Buffer |
| Glycerol, molecular-biology grade | Fisher | cat. no. BP229 | RNP Buffer |
| Taq Polymerase | Promega | cat. no. M712 | Genotyping |
| HEPES, cell culture grade | Sigma-Aldrich | cat. no. H4034 | RNP Buffer |
| HinfI (10,000 U/mL) | NEB | cat. no. R0155S | Genotyping |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs, | cat. no. E2040 | sgRNA Synthesis |
| Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG) | Millipore | cat. no. 230734 | Superovulation |
| Hyaluronidase/M2 | Millipore | cat. no. MR-051-F | Embryo Processing |
| KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids) | Zenith Biotech | cat. no. ZEKS-050 | Embryo Culture |
| LE agarose, analytical grade | BioExpress | cat. no. E-3120-500 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| M2 medium | Zenith Biotech | cat. no. ZFM2-050 | Embryo Processing |
| Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2) | Sigma-Aldrich | cat. no. M8266 | RNP and Lysis Buffer |
| Mineral Oil | Millipore | cat. no. ES-005C | Embryo Culture |
| Nonidet P-40,substitute (NP-40) | Sigma-Aldrich | cat. no. 74385 | Lysis Buffer |
| Nuclease-free water, molecular-biology grade | Ambion | cat. no. AM9937 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping | Integrated DNA Technologies | custom orders | sgRNA Design |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | cat. no. 31985062 | Embryo Culture |
| High-fidelity DNA polymerase | New England BioLabs, | cat. no. M0530 | sgRNA Synthesis |
| Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl) | Sigma-Aldrich | cat. no. P9333 | RNP and Lysis Buffer |
| Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG) | ProspecBio | cat. no. HOR-272 | Superovulation |
| Proteinase K, molecular-biology grade | Fisher | cat. no. BP1700-100 | Lysis Buffer |
| RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube | VWR | cat. no. 20170-333 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| RNase-free eight-well PCR strip tubes | VWR | cat. no. 82006-606 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Magnetic purification beads | GE Healthcare | cat. no. 65152105050250 | sgRNA Synthesis |
| Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | cat. no. C4706 | RNP Buffer |
| Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade | Teknova | cat. no. T1085 | Lysis Buffer |
| Tween 20 molecular-biology grade | Sigma-Aldrich | cat. no. P7949-500 | Lysis Buffer |
References
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
- Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
- Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system. Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).
- Kaneko, T., et al. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
- Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Biologie du développement. 445 (2), 156-162 (2019).
- Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
- Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).
- Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).
- Tröder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), 0196891 (2018).
- Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Génétique. 200 (2), 423-430 (2015).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Biologie du développement. 418 (1), 1-9 (2016).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation. Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Remy, S., et al. Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation. Scientific Reports. 7, 16554 (2017).
- Tanihara, F., et al. Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation. Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).
- Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes. Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).
- Nishio, K., et al. Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos. Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).
- Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Frontiers in Genetics. 11, 570069 (2020).
- Escoffre, J. M., et al. What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues. Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Modzelewski, A. J., et al. A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development. Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).
- Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
- Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 14811 (2019).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. Journal of Visualized Experiments. (3), e185 (2007).
- Takahashi, G., et al. GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice. Scientific Reports. 5, 11406 (2015).
- Tu, Z., et al. Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos. Scientific Reports. 7, 42081 (2017).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16 (1), 87 (2015).
- Zhu, L., et al. Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes. BMC Genomics. 10, 47 (2009).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
- Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. Designing and generating a mouse model: frequently asked questions. Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).
- Nakajima, K., et al. Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system. Scientific Reports. 6, 34703 (2016).
- Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nature Methods. 12 (6), 479 (2015).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
