En flödescytometribaserad cellytproteinbindningsanalys för bedömning av selektivitet och specificitet hos en anticanceraptamer
Summary
Ett nödvändigt steg i utvecklingen av aptamerer mot cancer är att testa dess bindning till målet. Vi demonstrerar en flödescytometrisk baserad analys för att studera denna bindning, med betoning på vikten av att inkludera en negativ kontrollaptamer och cancerceller som är positiva eller negativa för just det proteinet.
Abstract
En viktig utmaning i att utveckla en aptamer mot cancer är att effektivt bestämma selektiviteten och specificiteten hos den utvecklade aptameren till målproteinet. På grund av dess flera fördelar jämfört med monoklonala antikroppar har aptamerutveckling vunnit enorm popularitet bland cancerforskare. Systematisk utveckling av ligander genom exponentiell anrikning (SELEX) är den vanligaste metoden för att utveckla aptamerer som är specifika för proteiner av intresse. Efter Selex påskyndar en snabb och effektiv bindningsanalys identifieringsprocessen, vilket bekräftar aptamerens selektivitet och specificitet.
Detta papper förklarar en steg-för-steg-flödescytometrisk baserad bindningsanalys av en aptamer som är specifik för epitelcellulär vidhäftningsmolekyl (EpCAM). Transmembranglykoproteinet EpCAM är överuttryckt i de flesta karcinom och spelar roller i cancerinitiering, progression och metastasering. Därför är det en värdefull kandidat för riktad läkemedelsleverans till tumörer. För att utvärdera aptamerens selektivitet och specificitet till den membranbundna EpCAM krävs EpCAM-positiva och -negativa celler. Dessutom krävs en icke-bindande EpCAM-aptamer med liknande längd och 2-dimensionell (2D) struktur som den EpCAM-bindande aptameren. Bindningsanalysen inkluderar olika buffertar (blockeringsbuffert, tvättbuffert, inkubationsbuffert och FACS-buffert) och inkubationssteg.
Aptameren inkuberas med cellinjerna. Efter inkubations- och tvättstegen kommer cellerna att utvärderas med hjälp av en känslig flödescytometrianalys. Analys av resultaten visar bindningen av den EpCAM-specifika aptameren till EpCAM-positiva celler och inte de EpCAM-negativa cellerna. I EpCAM-positiva celler avbildas detta som en bandförskjutning i bindningen av EpCAM-aptameren till höger jämfört med den icke-bindande aptamerkontrollen. I EpCAM-negativa celler överlappar motsvarande band av EpCAM-bindande och -icke-bindande aptamerer varandra. Detta visar selektiviteten och specificiteten hos EpCAM aptamer. Även om detta protokoll är inriktat på EpCAM-aptamer, är protokollet tillämpligt på andra publicerade aptamerer.
Introduction
Cancer är fortfarande en av de främsta dödsorsakerna i världen1. Trots den betydande förbättringen av cancerbehandling under de senaste decennierna är läkemedelsutveckling mot cancer fortfarande ett mycket debatterat ämne. Detta beror på att kemoterapi, som grundpelaren i cancerbehandling, åtföljs av allvarliga biverkningar som begränsar patientens efterlevnad av behandlingen. Dessutom har kemoterapiinducerad cancerresistens mot behandling begränsat dess tillämpning som det enda valet av medicinsk intervention. Tillämpningen av monoklonala antikroppar (mAbs) introducerade ett förbättrat svar på cancerbehandlingar2. Motiveringen med att använda mAbs var att förbättra effekten av kemoterapeutik och minimera deras biverkningar. Men administrationen av mAbs blev också en utmaning. Detta berodde inte bara på de mAb-inducerade immunologiska reaktionerna utan också på de djurberoende och dyra produktionskostnaderna och svåra lagringsförhållandena3. Introduktion av aptamerer på 1990-talet4 väckte nya förhoppningar om cancerbehandling, eftersom tillämpningen av aptamerer kunde ta itu med de utmaningar som är förknippade med mAbs.
Aptamers är korta nukleinsyrasekvenser som specifikt produceras för ett visst mål. Systematisk utveckling av ligander genom exponentiell anrikning (SELEX) är en vanlig metod vid aptamerproduktion. I SELEX inkuberas proteinet av intresse med ett bibliotek av slumpmässiga nukleotidsekvenser, och genom en serie iterativa cykler renas den aptamer som är specifik för det proteinet. Aptamers har liknande målselektivitet och specificitet som mAbs, och därför visar läkemedelsutveckling inom detta område lovande framtida tillämpningar. Aptamers specifika för cancerbiomarkörer kan användas som enskilda läkemedel och cancerdiagnostiska verktyg 5,6,7. På grund av sin nanostora struktur kan dessa aptamerer också fungera som läkemedelsbärare för att leverera cytotoxiska medel specifikt till tumören8. Detta skulle öka effekten av riktad läkemedelsleverans och minska kemoterapi-associerade, off-target biverkningar. Dessutom har dessa nanomediciner en hög vävnadspenetration, vilket gör dem till en önskvärd kandidat för djuptumörläkemedelsleverans och behandling. Aptamers kan också utformas för att rikta in sig på transportörerna uttryckta på blod-hjärnbarriären (BBB) för att förbättra läkemedelsleveransen till hjärntumörer9. Ett bra exempel på en sådan aptamer är bifunktionella aptamerer, riktade mot transferrinreceptorn (TfR)10 för att förbättra läkemedelsleveransen över BBB och levererar en cytotoxisk läkemedelsnyttolast till tumörceller11.
Trots alla fördelar med aptamerer har läkemedelsutveckling inom detta område ännu inte gett ett marknadsfört, framgångsrikt läkemedel mot cancer. En anledning till detta kan vara bristen på standard- och reproducerbara metoder som kan följas globalt av forskare inom området. I detta dokument demonstreras ett steg-för-steg-protokoll för en aptamerbindning till ett inbyggt protein uttryckt på cellytan. Detta protokoll är ett försprång i den prekliniska bedömningen av anticanceraptamerer. Analysen utförs för att visa selektiviteten och specificiteten hos den renade aptameren som samlats in från SELEX eller en publicerad aptamersekvens för bekräftelse av selektivitet och specificitet. Denna flödescytometriska baserade analys är en snabb, pålitlig, känslig analys som exakt visar aptamerens selektivitet och specificitet, där aptameren testas mot proteiner på cellytan12,13,14. Denna metod demonstreras med hjälp av bindningen av en aptamer som är specifik för EpCAM som visas i detta dokument15. EpCAM, som ett transmembranglykoprotein, spelar roller i tumörcellssignalering, progression, migration och metastasering16,17. För att visa selektiviteten och specificiteten hos denna aptamer användes EpCAM-positiva och -negativa cancerceller. Den tidigare utvecklade EpCAM-specifika aptameren, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′), och en negativ kontrollaptamer, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), användes som EpCAM-bindande respektive -icke-bindande aptamerer10. 3′-änden av både TEPP och TENN var märkta med en TYE665-fluorofor.
TEPP är en bifunktionell aptamer som riktar sig mot EpCAM från ena änden och TfR i den andra. Detta har gjort TEPP till en lämplig kandidat för läkemedelsleverans till EpCAM+ hjärntumörer. Med hjälp av sin TfR-specifika ände passerar TEPP blod-hjärnbarriären och med hjälp av den EpCAM-specifika änden hittar TEPP tumören och levererar dess last (t.ex. cytotoxiska läkemedel) till tumören. TENN har en liknande längd och 2D-struktur som TEPP, men den har inte affinitet för EpCAM eller TfR, och är därför en lämplig negativ kontrollaptamer. Med hjälp av TEPP och TENN visas testning av bindningen av en aptamer till målproteinet med hjälp av flödescytometri i detta dokument. Detta protokoll gäller för utveckling av cellspecifika aptamerer. Det är också tillämpligt på ytterligare kompletterande och konfirmationsanalyser av de aptamersekvenser som finns tillgängliga i litteraturen. Protokollet kan också användas av de som är nya inom aptamerområdet och som tittar på att använda en tidigare publicerad aptamer för sina forsknings- och utvecklingsändamål (R&D). I denna uppsats studeras två aptamersekvenser som finns tillgängliga i litteraturen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den största utmaningen med att utveckla nya aptamerer är bristen på standardriktlinjer som gäller för olika steg i denna process. har nyligen visat några av de tillhörande utmaningarna, vilket leder till oklara presentationer av data i publikationer och misslyckande med att replikera forskningen. De föreslog grundläggande riktlinjer som är nödvändiga för övervägande vid karakterisering av aptamerer19. En aptamerbindningsanalys är ett kritiskt steg i screening och / eller karakteris…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner Institute for Mental and Physical Health and Clinical Translation (IMPACT) SEED-finansiering, programmet “Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship” vid Deakin University och “Australian Government Research Training Program Scholarship”.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid | Sigma-Aldrich | T6649 | |
| 15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube | Greiner Bio One | 188271 | |
| 5 mL serological pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer | Becton Dickinson | N/A | |
| BD FACSDiva V9.0 | BD Biosciences | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder | Sigma-AldrichTM | A7906-50G | |
| Bright-line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder | Life Technologies | 12100046 | |
| Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21300025 | |
| FlowJo, LLC 10.8.1 | BD Biosciences | N/A | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| HEK293T | American Type Culture Collection | ACS-4500 | |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Heraeus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black | Greiner Bio One | 655076 | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets | Life Technologies | 18912014 | |
| Pyrogen- and RNase-free ultrapure water | Milli-Q | ||
| T75 Cell Culture flask | Cellstar | 658170 | |
| TENN | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3 |
| TEPP | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′ |
| Transfer RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8508-5X1ML | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
References
- Cancer. World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers (2022)
- Liu, J. K. H. The history of monoclonal antibody development – Progress, remaining challenges and future innovations. Annals of Medicine and Surgery. 3 (4), 113-116 (2014).
- Nakhjavani, M., Shigdar, S. Future of PD-1/PD-L1 axis modulation for the treatment of triple-negative breast cancer. Pharmacological Research. 175, 106019 (2022).
- Bukari, B., Samarasinghe, R. M., Noibanchong, J., Shigdar, S. L. Non-invasive delivery of therapeutics into the brain: the potential of aptamers for targeted delivery. Biomedicines. 8 (5), 120 (2020).
- Wu, X., Chen, J., Wu, M., Zhao, J. X. Aptamers: active targeting ligands for cancer diagnosis and therapy. Theranostics. 5 (4), 322 (2015).
- Feng, X., et al. The aptamer functionalized nanocomposite used for prostate cancer diagnosis and therapy. Journal of Nanomaterials. 2022, (2022).
- Huang, J., et al. Advances in aptamer-based biomarker discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 571 (2021).
- Ashrafuzzaman, M. Aptamers as both drugs and drug-carriers. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Nakhjavani, M., Samarasinghe, R. M., Shigdar, S. Triple-negative breast cancer brain metastasis: an update on druggable targets, current clinical trials, and future treatment options. Drug Discovery Today. , (2022).
- Macdonald, J., et al. Development of a bifunctional aptamer targeting the transferrin receptor and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) for the treatment of brain cancer metastases. ACS Chemical Neuroscience. 8 (4), 777-784 (2017).
- Macdonald, J., et al. Bifunctional aptamer-doxorubicin conjugate crosses the blood-brain barrier and selectively delivers its payload to EpCAM-positive tumor cells. Nucleic Acid Therapeutics. 30 (2), 117-128 (2020).
- Shigdar, S., Agnello, L., Fedele, M., Camorani, S., Cerchia, L. Profiling cancer cells by cell-SELEX: use of aptamers for discovery of actionable biomarkers and therapeutic applications thereof. Pharmaceutics. 14 (1), 28 (2021).
- Rahimizadeh, K., et al. Development of cell-specific aptamers: recent advances and insight into the selection procedures. Molecules. 22 (12), 2070 (2017).
- Chen, M., et al. Development of cell-SELEX technology and its application in cancer diagnosis and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 2079 (2016).
- Shigdar, S., et al. The use of sensitive chemical antibodies for diagnosis: detection of low levels of EpCAM in breast cancer. PLoS One. 8 (2), 57613 (2013).
- Ni, J., et al. Role of the EpCAM (CD326) in prostate cancer metastasis and progression. Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3), 779-791 (2012).
- Ni, J., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is associated with prostate cancer metastasis and chemo/radioresistance via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (12), 2736-2748 (2013).
- McKeague, M., Kruse, P. F., Patterson, M. K., et al. . Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- McKeague, M., et al. The minimum aptamer publication standards (MAPS guidelines) for de novo aptamer selection. Aptamers. 6, 10-18 (2022).
- Schoofs, G., Van Hout, A., D’huys, T., Schols, D., Van Loy, T. A flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled CXC Chemokine ligand 12 to CXC Chemokine receptor 4. Journal of Visualized Experiments. (133), e57271 (2018).
- McKinnon, K. M. Flow cytometry: an overview. Current Protocols in Immunology. 120 (1), 1-11 (2018).
- Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglu, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
- Ruscito, A., DeRosa, M. C. Small-molecule binding aptamers: Selection strategies, characterization, and applications. Frontiers in Chemistry. 4, 14 (2016).
- McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
- Henri, J., Bayat, N., Macdonald, J., Shigdar, S. A guide to using nucleic acid aptamers in cell based assays. Aptamers. 23, (2019).
- Mao, H., et al. The mechanism and regularity of quenching the effect of bases on fluorophores: the base-quenched probe method. Analyst. 143 (14), 3292-3301 (2018).
- McKeague, M., et al. Analysis of in vitro aptamer selection parameters. Journal of Molecular Evolution. 81 (5), 150-161 (2015).
- Chen, B., et al. Targeting negative surface charges of cancer cells by multifunctional nanoprobes. Theranostics. 6 (11), 1887 (2016).
- Shigdar, S., et al. RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133. Cancer Letters. 330 (1), 84-95 (2013).
- Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method. Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).
- Yu, X. -. X., et al. Selection and characterization of a novel DNA aptamer, Apt-07S specific to hepatocellular carcinoma cells. Drug Design, Development and Therapy. 14, 1535 (2020).
