JoVE Journal > Immunology and Infection
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Immunologie et infection

Evaluación de la activación de la caspasa para evaluar la muerte celular inmune innata

Published: January 20, 2023
doi:
10.3791/64308
, ,
1Department of Immunology,St. Jude Children’s Research Hospital

Summary

Este protocolo describe un método integral para evaluar la activación de caspasas (caspasa-1, caspasa-3, caspasa-7, caspasa-8, caspasa-9 y caspasa-11) en respuesta a modelos de infección, insultos estériles y cáncer tanto in vitro como in vivo (en ratones) para determinar el inicio de vías de muerte celular, como piroptosis, apoptosis, necroptosis y PANoptosis.

Abstract

La inmunidad innata proporciona la primera línea crítica de defensa en respuesta a patógenos e insultos estériles. Un componente mecanicista clave de esta respuesta es el inicio de la muerte celular programada inmune innata (PCD) para eliminar las células infectadas o dañadas y propagar las respuestas inmunes. Sin embargo, el exceso de PCD se asocia con inflamación y patología. Por lo tanto, comprender la activación y regulación de la PCD es un aspecto central de la caracterización de las respuestas inmunes innatas y la identificación de nuevos objetivos terapéuticos en todo el espectro de la enfermedad.

Este protocolo proporciona métodos para caracterizar la activación innata de PCD inmune mediante el monitoreo de caspasas, una familia de proteasas dependientes de cisteína que a menudo se asocian con diversas vías de PCD, incluyendo apoptosis, piroptosis, necroptosis y PANoptosis. Los informes iniciales caracterizaron la caspasa-2, la caspasa-8, la caspasa-9 y la caspasa-10 como caspasas iniciadoras y la caspasa-3, caspasa-6 y caspasa-7 como caspasas efectoras en la apoptosis, mientras que estudios posteriores encontraron que las caspasas inflamatorias, caspasa-1, caspasa-4, caspasa-5 y caspasa-11, impulsan la piroptosis. Ahora se sabe que existe una amplia diafonía entre las caspasas y otras moléculas innatas inmunes y de muerte celular a través de las vías de PCD previamente definidas, identificando una brecha de conocimiento clave en la comprensión mecanicista de la inmunidad innata y PCD y conduciendo a la caracterización de PANoptosis. PANoptosis es una vía PCD inflamatoria inmune innata única regulada por complejos PANoptosomas, que integran componentes, incluidas las caspasas, de otras vías de muerte celular.

Aquí, se proporcionan métodos para evaluar la activación de las caspasas en respuesta a diversos estímulos. Estos métodos permiten la caracterización de las vías de PCD tanto in vitro como in vivo, ya que las caspasas activadas experimentan una escisión proteolítica que puede visualizarse mediante western blot utilizando anticuerpos óptimos y condiciones de blotting. Se ha establecido un protocolo y un flujo de trabajo de western blotting que permiten evaluar la activación de múltiples caspasas de la misma población celular, proporcionando una caracterización integral de los procesos de PCD. Este método se puede aplicar en todas las áreas de investigación en desarrollo, homeostasis, infección, inflamación y cáncer para evaluar las vías de PCD a lo largo de los procesos celulares en la salud y la enfermedad.

Introduction

El sistema inmune innato actúa como la primera línea de defensa durante la infección y en respuesta a estímulos estériles, como lesiones tisulares y alteraciones en la homeostasis. Los sensores inmunes innatos en la superficie celular y en el citoplasma responden a patrones moleculares asociados a patógenos o daños (PAMP o DAMP, respectivamente) para desencadenar vías de señalización inflamatoria y respuestas celulares. Uno de los procesos clave de la respuesta inmune innata es la inducción de la muerte celular para eliminar las células infectadas o dañadas e impulsar más respuestas inmunes innatas y adaptativas. La muerte celular programada (PCD) es un proceso altamente conservado en todas las especies, destacando su importancia evolutiva como mecanismo inmune innato.

Hay varias vías innatas inmunes de PCD que pueden activarse en todos los tipos de células. Las caspasas son una familia clave de proteasas altamente conservadas, intracelulares y dependientes de cisteína que son críticas en muchas vías de PCD, incluida la vía de apoptosis tradicionalmente no inflamatoria, así como las vías inflamatorias de PCD como piroptosis, necroptosis y PANoptosis 1,2,3,4,5 . Hay 11 caspasas humanas y 10 murinas que están bien definidas, así como pseudo-caspasas que pueden ser funcionales, y la mayoría se expresan constitutivamente como pro-caspasas monoméricas o diméricas inactivas que requieren escisión para la activación 6,7. Las caspasas también contienen dominios importantes para el reclutamiento y la formación de complejos multiproteicos. Estos incluyen el dominio de activación y reclutamiento de caspasas (CARD), que se puede encontrar en caspasa-1, caspasa-2, caspasa-4, caspasa-5, caspasa-9 y caspasa-11, o el dominio efector de muerte (DED), que se encuentra en caspasa-8 y caspasa-10. A través de su actividad proteolítica y su capacidad para formar complejos multiproteicos, las caspasas son impulsores críticos de la PCD inmune innata.

El papel de las caspasas en la PCD inmune innata se identificó por primera vez en la apoptosis, donde las caspasas iniciadoras, caspasa-2, caspasa-8, caspasa-9 y caspasa-10, activan las caspasas verdugo, caspasa-3, caspasa-6 y caspasa-7, para conducir a la muerte celular 8,9,10,11,12. Las caspasas del iniciador pueden activarse mediante diversas cascadas de señalización; La vía extrínseca activa la caspasa-8 a través de la señalización del receptor de muerte inducida por ligandos extracelulares, y la vía intrínseca activa la caspasa-9 a través de la interrupción de la integridad mitocondrial13. Las caspasas iniciadoras activadas escinden el enlazador separando las subunidades catalíticas grandes y pequeñas de las caspasas ejecutoras para producir sus formas activas. Las caspasas verdugos luego escinden sus sustratos para desmontar la célula, lo que resulta en la degradación del ADN, el blebbing de la membrana, la fragmentación nuclear y la liberación de cuerpos apoptóticos14,15. Este proceso típicamente termina en una forma no lítica y no inflamatoria de muerte celular cuando se combina con la eliminación inmediata de las células moribundas por eferocitosis16. Sin embargo, los defectos en la eferocitosis o la falta de células fagocíticas pueden conducir a la acumulación de células apoptóticas, que luego sufren la muerte celular lítica e inflamatoria17,18.

Se ha descubierto que las caspasas inflamatorias, incluidas la caspasa-1 (humana y ratón), la caspasa-4 y la caspasa-5 (humana) y la caspasa-11 (ratón), se activan durante una forma de PCD INMUNE INNATA INFLAMATORIA (III-PCD) llamada piroptosis. La activación de la caspasa-1 se asocia con la formación de inflamasomas, que son complejos multiproteicos que contienen un sensor inmune innato citosólico, una molécula adaptadora (proteína moteada asociada a la apoptosis que contiene una CARD [ASC]) y caspasa-1. La formación de este complejo permite que la caspasa-1 se someta a una autoproteólisis mediada por proximidad para liberar su forma activa, que puede escindir sustratos diana incluyendo las citoquinas proinflamatorias interleucina (IL)-1β e IL-18 y la molécula formadora de poros gasdermina D (GSDMD)19,20,21,22,23 . La caspasa-11, la caspasa-4 y la caspasa-5 también pueden activar la GSDMD sin la formación aguas arriba del inflamasoma después de detectar PAMPs como el lipopolisacárido (LPS)19,20. Estas caspasas sufren dimerización seguida de oligomerización y autoescisión para la activación al unirse a LPS citosólico, lo que conduce a la activación no canónica del inflamasoma 24,25,26 y la activación de la caspasa-1 de manera intrínseca celular para inducir la maduración de IL-1β e IL-18 20. La maduración y liberación de estas citoquinas proinflamatorias caracterizan a estas caspasas como “inflamatorias”. Además, se ha encontrado que la caspasa-8 apoptótica se localiza en el inflamasoma, proporcionando un vínculo entre los procesos apoptóticos y piroptóticos. Los estudios han encontrado que la caspasa-8 apoptótica también es crítica para regular otra forma de PCD llamada necroptosis. La pérdida de caspasa-8 da como resultado la activación espontánea de la serina-treonina quinasa 3 (RIPK3) mediada por el receptor de serina-treonina quinasa 3 (RIPK3) mediada por la pseudoquinasa de linaje mixto (MLKL) para impulsar la vía III-PCD de necroptosis 27,28,29,30,31,32,33,34,35.

Mientras que las caspasas han sido históricamente clasificadas como “apoptóticas” o “inflamatorias” en función del tipo de muerte celular que inician, la creciente evidencia sugiere que existe una amplia diafonía entre las vías innatas inmunes de PCD a través de caspasas 3,4. Por ejemplo, la caspasa-1 inflamatoria de los inflamasomas escinde la caspasa-7 apoptótica en su sitio de activación canónica34. La activación de la caspasa-1 también puede conducir a la escisión de sustratos apoptóticos como la poli(ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP1)36. En las células que carecen de GSDMD, la caspasa-1 también puede escindir la caspasa-337,38. Además, la caspasa-3 canónicamente apoptótica puede escindir la gasdermina E (GSDME) para inducir PCD17,18 y también procesa GSDMD en una forma inactiva40. Además, se ha observado el reclutamiento de caspasa-8 para el complejo inflamasoma 39,40,41,42,43,44,45, y la caspasa-8 es un regulador clave de la activación del inflamasoma canónico y no canónico 39. También hay roles superpuestos y redundantes para la caspasa-8 y la caspasa-1 en muchas condiciones inflamatorias, y la PCD inmune innata caracterizada por la activación de componentes piroptóticos, apoptóticos y necroptóticos ocurre en todo el espectro de la enfermedad 39,46,47,48,49,50.

Sobre la base de esta diafonía entre las caspasas inflamatorias y apoptóticas, se identificó una brecha clave en la comprensión mecanicista de la inmunidad innata y la PCD, lo que llevó al descubrimiento de la PANoptosis. PANoptosis es una forma única de III-PCD que se activa en respuesta a patógenos, PAMP, DAMP y alteraciones en la homeostasis y está regulada por PANoptosomas, complejos macromoleculares multifacéticos que integran componentes de otras vías de muerte celular 44,50,51,52,53,54,55 . La totalidad de los efectos biológicos en la PANoptosis no pueden explicarse individualmente por piroptosis, apoptosis o necroptosis solas 3,4,35,36,39,46,47,48, ya que la PANoptosis se caracteriza por la activación de múltiples caspasas, incluyendo caspasa-1, caspasa-11, caspasa-8, caspasa-9, caspasa-3 y/o caspasa-7, dependiendo del contexto 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . La PANoptosis ha sido cada vez más implicada en enfermedades infecciosas e inflamatorias, así como en cánceres y terapias contra el cáncer 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.

Dado el papel esencial de las caspasas a través de las vías de muerte celular, incluso en la apoptosis, la piroptosis, la necroptosis y la PANoptosis, es importante desarrollar técnicas para caracterizar su activación y comprender toda la complejidad de las vías de PCD. El protocolo aquí detalla un método para estimular las células y medir la activación posterior de las caspasas (Figura 1). Este método aprovecha la escisión proteolítica de las caspasas, que generalmente se requiere para su activación, como un medio para estudiarlas. A través de Western blotting, se pueden determinar los tamaños de las proteínas, lo que permite la visualización clara y la diferenciación de las pro-caspasas inactivas y sus formas activadas y escindidas.

Las principales ventajas de este protocolo son 1) su capacidad para evaluar la activación de múltiples caspasas en paralelo de una sola población de células endógenas para determinar con mayor precisión la activación de PCD y 2) el uso de técnicas de laboratorio relativamente simples que no requieren una capacitación extensa o equipos costosos. Los protocolos anteriores han utilizado Western blotting, reporteros fluorescentes o tinción de anticuerpos para monitorear la activación de caspasas en sobrenadantes de cultivo, lisados celulares y tisulares, células enteras mediante microscopía e in vivo 67,68,69,70,71, pero estas técnicas generalmente solo monitorean una o dos caspasas en una muestra. Además, mientras que los sustratos peptídicos sintéticos que contienen sitios de escisión de caspasa que fluorescen sobre la escisión se han utilizado para monitorear la activación de caspasas en lisados celulares o tisulares69, estos sustratos a menudo pueden ser escindidos por más de una caspasa, lo que dificulta determinar la activación específica de caspasas individuales en este sistema. Además, el uso de Western blot en lugar del uso de reporteros fluorescentes u otros métodos basados en etiquetas permite a los investigadores usar células endógenas en lugar de crear líneas celulares específicas con genes reporteros. El uso de células endógenas tiene múltiples ventajas, incluido el hecho de que muchas líneas celulares inmortalizadas son deficientes en moléculas clave de muerte celular72,73, lo que podría afectar los resultados. Además, el uso de células endógenas permite la evaluación de diversos tipos de células, como macrófagos, células epiteliales y células endoteliales, en lugar de un solo linaje. Western blot también es una técnica relativamente simple y rentable que se puede llevar a cabo en laboratorios de todo el mundo sin la necesidad de equipos grandes y costosos o configuraciones complicadas.

Este protocolo es ampliamente aplicable en toda la biología para comprender las funciones dependientes de la muerte celular e independientes de la muerte celular de las caspasas, incluidas sus funciones de andamiaje y funciones en otras vías de señalización inflamatoria74. La aplicación de este método permite un enfoque unificado en el estudio de las vías innatas inmunes de PCD y la señalización inflamatoria a través de enfermedades y afecciones, y este protocolo se puede utilizar para identificar procesos regulatorios críticos y conexiones mecanicistas que informarán el desarrollo de futuras estrategias terapéuticas.

Protocol

El uso y los procedimientos de los animales fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales del St. Jude Children’s Research Hospital. 1. Preparación de las soluciones Prepare los medios acondicionados para L929.Placa 1 × 106 células L929 (ver Tabla de materiales) en un matraz de cultivo de tejidos de 182cm2 que contiene 50 ml de medios de cultivo L929 (ver Tabla 1 para la preparación de…

Representative Results

La PANoptosis se ha observado en respuesta a numerosas infecciones bacterianas, virales y fúngicas y otros estímulos inflamatorios, así como en células cancerosas 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 <s…

Discussion

El monitoreo de la escisión y activación de la caspasa proporciona una de las imágenes más completas de la activación innata de PCD inmune como parte de la respuesta inmune innata. El protocolo descrito aquí demuestra una estrategia para monitorizar la activación de caspasas en respuesta a infecciones por IAV, HSV1 y F. novicida y el desencadenante estéril LPS+ATP, pero muchos otros estímulos pueden inducir PCD y podrían ser utilizados en este método, como se ha demostrado en varias publicaciones 44,4…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a los miembros del laboratorio de Kanneganti por sus comentarios y sugerencias, y agradecemos a J. Gullett, PhD, por el apoyo de edición científica. El trabajo en nuestro laboratorio está respaldado por las subvenciones AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 y CA253095 (a T.-D.K.) y por las Caridades Asociadas Libanesas Sirias Americanas (a T.-D.K.). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Materials

0.45 μm filter Millipore SCHVU05RE
10 mL syringe BD Biosciences 309604
12% polyacrylamide gel with 10 wells  Bio-Rad 4561043
12-well plate  Corning 07-200-82
18 G needle  BD Biosciences 305195
25 G needle  BD Biosciences 305122
50 mL tube  Fisher Scientific 50-809-218
70 μm cell strainer  Corning 431751
150 mm tissue culture dishes Corning 430597
182-cm2 tissue culture flask Genesee Scientific 25-211
Accessory white trans tray Cytiva 29-0834-18
Anti–caspase-1 antibody AdipoGen AG-20B-0042-C100
Anti–caspase-11 antibody Novus Biologicals NB120-10454
Anti–caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9662
Anti–caspase-7 antibody Cell Signaling Technology 9492
Anti–caspase-8 antibody Cell Signaling Technology 4927
Anti–caspase-9 antibody Cell Signaling Technology 9504
Anti–cleaved caspase-3 antibody  Cell Signaling Technology 9661
Anti–cleaved caspase-7 antibody  Cell Signaling Technology 9491
Anti–cleaved caspase-8 antibody  Cell Signaling Technology 8592
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 315-035-047
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-047
Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 112-035-003
Anti–β-Actin antibody (C4) HRP Santa Cruz sc-47778 HRP
ATP InvivoGen tlrl-atpl
BBL Trypticase Soy Broth BD Biosciences 211768
Bead bath Chemglass Life Sciences CLS-4598-009
Biophotometer D30 Eppendorf 6133000010
BME Sigma M6250
Bromophenol blue  Sigma BO126
Cell scrapers CellTreat Scientific Products 229315
Chemiluminescence imager (Amersham 600)  Cytiva 29083461
CO2 chamber VetEquip 901703
Cuvettes Fisher Scientific 14-955-129
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 221S
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995-073
DTT Sigma 43815
Eelectrophoresis apparatus  Bio-Rad 1658004
Ethanol Pharmco 111000200
Fetal bovine serum  Biowest S1620
Filter paper Bio-Rad 1703965
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Francisella novicida (U112 strain) BEI Resources NR-13
Gel releaser  Bio-Rad 1653320
Gentamycin Gibco 15750060
Glycerol Sigma G7893
Glycine Sigma G8898
HCl Sigma H9892
Heat block Fisher Scientific 23-043-160
Herpes simplex virus 1 (HF strain) ATCC VR-260
High glucose DMEM  Sigma D6171
Human anti–caspase-1 antibody R&D Systems MAB6215
Human anti–caspase-8 antibody Enzo ALX-804-242
Humidified incubator  Thermo Fisher Scientific 51026282
Image analysis software ImageJ v1.53a
IMDM Thermo Fisher Scientific 12440-053
Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])  constructed per Hoffmann et al.
L929 cells ATCC CCL-1 cell line for creating L929-conditioned media
L-cysteine  Thermo Fisher Scientific BP376-100
Luminata Forte Western HRP substrate Millipore WBLUF0500 standard-sensitivity HRP substrate
MDCK cells ATCC CCL-34 cell line for determining IAV viral titer
Methanol Sigma 322415
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002401
Non-essential amino acids  Gibco 11140050
Nonfat dried milk powder Kroger
NP-40 solution  Sigma 492016
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023
Penicillin and streptomycin  Sigma P4333
Petri dish Fisher Scientific 07-202-011
PhosSTOP Roche PHOSS-RO
Power source  Bio-Rad 164-5052
Protease inhibitor tablet Sigma S8820
PVDF membrane  Millipore IPVH00010
Rocking shaker Labnet S2035-E
SDS Sigma L3771
Sodium chloride  Sigma S9888
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Sodium hydroxide Sigma 72068
Sodium pyruvate  Gibco 11360-070
Square Petri dish Fisher Scientific FB0875711A
Stripping buffer Thermo Fisher Scientific 21059
Super Signal Femto HRP substrate Thermo Fisher Scientific 34580 high-sensitivity HRP substrate
Tabletop centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004524
Trans-Blot semi-dry system  Bio-Rad 170-3940
Tris Sigma TRIS-RO
Tween 20  Sigma P1379
Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 InvivoGen tlrl-3pelps
Vero cells ATCC CCL-81 cell line for determining HSV1 viral titer
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References

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Citer Cet Article
Han, J., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death. J. Vis. Exp. (191), e64308, doi:10.3791/64308 (2023).
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