JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

Utvärdering av kaspasaktivering för att bedöma medfödd immuncellsdöd

Published: January 20, 2023
doi:
10.3791/64308
, ,
1Department of Immunology,St. Jude Children’s Research Hospital

Summary

Detta protokoll beskriver en omfattande metod för att bedöma kaspasaktivering (kaspas-1, kaspas-3, kaspas-7, kaspas-8, kaspas-9 och kaspas-11) som svar på både in vitro – och in vivo (hos möss) modeller av infektion, sterila förolämpningar och cancer för att bestämma initieringen av celldödsvägar, såsom pyroptos, apoptos, nekrotos och PANoptos.

Abstract

Medfödd immunitet ger den kritiska första försvarslinjen som svar på patogener och sterila förolämpningar. En viktig mekanistisk komponent i detta svar är initieringen av medfödd immunprogrammerad celldöd (PCD) för att eliminera infekterade eller skadade celler och sprida immunsvar. Överskott av PCD är emellertid förknippat med inflammation och patologi. Att förstå aktivering och reglering av PCD är därför en central aspekt för att karakterisera medfödda immunsvar och identifiera nya terapeutiska mål över sjukdomsspektrumet.

Detta protokoll tillhandahåller metoder för att karakterisera medfödd immun-PCD-aktivering genom att övervaka kaspaser, en familj av cysteinberoende proteaser som ofta är associerade med olika PCD-vägar, inklusive apoptos, pyroptos, nekrotos och PAN-optos. Initiala rapporter karakteriserade kaspas-2, kaspas-8, kaspas-9 och kaspas-10 som initiatorkaser och kaspas-3, kaspas-6 och kaspas-7 som effektorkaspaser vid apoptos, medan senare studier fann att inflammatoriska kaspaser, kaspas-1, kaspas-4, kaspas-5 och kaspas-11, driver pyroptos. Det är nu känt att det finns omfattande överhörning mellan kaspaser och andra medfödda immun- och celldödsmolekyler över de tidigare definierade PCD-vägarna, vilket identifierar en viktig kunskapslucka i den mekanistiska förståelsen av medfödd immunitet och PCD och leder till karakterisering av PANoptos. PANoptos är en unik medfödd immuninflammatorisk PCD-väg som regleras av PANoptosom-komplex, som integrerar komponenter, inklusive kaspaser, från andra celldödsvägar.

Här tillhandahålls metoder för att bedöma aktiveringen av kaspaser som svar på olika stimuli. Dessa metoder möjliggör karakterisering av PCD-vägar både in vitro och in vivo, eftersom aktiverade kaspaser genomgår proteolytisk klyvning som kan visualiseras genom western blotting med optimala antikroppar och blottningsförhållanden. Ett protokoll och western blotting workflow har upprättats som möjliggör bedömning av aktivering av flera kaspaser från samma cellulära population, vilket ger en omfattande karakterisering av PCD-processerna. Denna metod kan tillämpas över forskningsområden inom utveckling, homeostas, infektion, inflammation och cancer för att utvärdera PCD-vägar genom cellulära processer inom hälsa och sjukdom.

Introduction

Det medfödda immunsystemet fungerar som den första försvarslinjen under infektion och som svar på sterila stimuli, såsom vävnadsskada och förändringar i homeostas. Medfödda immunsensorer på cellytan och i cytoplasman svarar på patogen- eller skadeassocierade molekylära mönster (PAMPs respektive DAMPs) för att utlösa inflammatoriska signalvägar och cellulära svar. En av nyckelprocesserna för det medfödda immunsvaret är induktionen av celldöd för att avlägsna infekterade eller skadade celler och driva ytterligare medfödda och adaptiva immunsvar. Programmerad celldöd (PCD) är en mycket bevarad process över arter, vilket belyser dess evolutionära betydelse som en medfödd immunmekanism.

Det finns flera medfödda immun-PCD-vägar som kan aktiveras i alla celltyper. Caspaser är en nyckelfamilj av högbevarade, intracellulära, cysteinberoende proteaser som är kritiska över många PCD-vägar, inklusive den traditionellt icke-inflammatoriska apoptosvägen, liksom inflammatoriska PCD-vägar såsom pyroptos, nekrotos och PANoptos 1,2,3,4,5 . Det finns 11 humana och 10 murina kaspaser som är väldefinierade, liksom pseudokaspaser som kan vara funktionella, och de flesta uttrycks konstitutivt som inaktiva monomera eller dimera pro-kaspaser som kräver klyvning för aktivering 6,7. Caspases innehåller också viktiga domäner för rekrytering och bildning av multiproteinkomplex. Dessa inkluderar caspase activation and recruitment domain (CARD), som finns i caspase-1, caspase-2, caspase-4, caspase-5, caspase-9 och caspase-11, eller death effector domain (DED), som finns i caspase-8 och caspase-10. Genom både deras proteolytiska aktivitet och deras förmåga att bilda multiproteinkomplex är kaspaser kritiska drivkrafter för medfödd immun-PCD.

Kaspasernas roll i medfödd immun-PCD identifierades först vid apoptos, där initiatorns kaspaser, caspase-2, caspase-8, caspase-9 och caspase-10, aktiverar bödelkaspaser, caspase-3, caspase-6 och caspase-7, för att driva celldöd 8,9,10,11,12. Initiatorkaspaser kan aktiveras av olika signalkaskader; Den yttre vägen aktiverar kaspas-8 genom extracellulär ligandinducerad dödsreceptorsignalering, och den inneboende vägen aktiverar kaspas-9 genom störning av mitokondriell integritet13. Aktiverade initiatorkaspaser klyver länkaren som separerar de stora och små katalytiska underenheterna av bödelkaspaser för att producera sina aktiva former. Bödelns kaspaser klyver sedan sina substrat för att demontera cellen, vilket resulterar i DNA-nedbrytning, membranblåsning, kärnfragmentering och frisättning av apoptotiska kroppar14,15. Denna process slutar vanligtvis i en icke-lytisk och icke-inflammatorisk form av celldöd när den kombineras med omedelbar rensning av de döende cellerna genom efferocytos16. Defekter i efferocytos eller brist på fagocytiska celler kan emellertid leda till ackumulering av apoptotiska celler, som sedan genomgår lytisk och inflammatorisk celldöd17,18.

De inflammatoriska kaspaserna, inklusive kaspas-1 (människa och mus), kaspas-4 och kaspas-5 (människa) och kaspas-11 (mus), har upptäckts aktiveras under en form av inflammatorisk medfödd immun-PCD (III-PCD) som kallas pyroptos. Kaspas-1-aktivering är associerad med bildandet av inflammasomer, vilka är multiproteinkomplex innehållande en cytosolisk medfödd immunsensor, en adaptermolekyl (apoptosassocierat fläckliknande protein innehållande ett CARD [ASC]) och kaspas-1. Bildningen av detta komplex tillåter kaspas-1 att genomgå närhetsmedierad autoproteolys för att frigöra sin aktiva form, vilket kan klyva målsubstrat inklusive de proinflammatoriska cytokinerna interleukin (IL) -1β och IL-18 och den porbildande molekylen gasdermin D (GSDMD) 19,20,21,22,23 . Kaspas-11, kaspas-4 och kaspas-5 kan också aktivera GSDMD utan uppströmsbildning av inflammasomen efter avkänning av PAMPs såsom lipopolysackarid (LPS)19,20. Dessa kaspaser genomgår dimerisering följt av oligomerisering och självklyvning för aktivering vid bindning till cytosolisk LPS, vilket leder till icke-kanonisk inflammasomaktivering 24,25,26 och kaspas-1-aktivering på ett cellinneboende sätt för att inducera IL-1β och IL-18-mognad 20. Mognaden och frisättningen av dessa proinflammatoriska cytokiner karakteriserar dessa kaspaser som “inflammatoriska”. Dessutom har den apoptotiska kaspas-8 visat sig lokaliseras till inflammasomen, vilket ger en länk mellan apoptotiska och pyroptotiska processer. Studier har visat att den apoptotiska kaspas-8 också är avgörande för att reglera en annan form av PCD som kallas nekrotros. Förlusten av kaspas-8 resulterar i spontan receptorinteragerande serin-treoninkinas 3 (RIPK3)-medierad blandad härstamningskinas domänliknande pseudokinas (MLKL) aktivering för att driva III-PCD-vägen för nekroptos 27,28,29,30,31,32,33,34,35.

Medan kaspaser historiskt har klassificerats som “apoptotiska” eller “inflammatoriska” baserat på vilken typ av celldöd de initierar, tyder växande bevis på att det finns omfattande överhörning mellan de medfödda immun-PCD-vägarna genom kaspaser 3,4. Till exempel klyver den inflammatoriska kaspas-1 från inflammasomer den apoptotiska kaspas-7 vid dess kanoniska aktiveringsställe34. Kaspas-1-aktivering kan också leda till klyvning av apoptotiska substrat såsom poly(ADP-ribos) polymeras 1 (PARP1)36. I celler som saknar GSDMD kan kaspas-1 också klyva kaspas-337,38. Dessutom kan den kanoniskt apoptotiska kaspas-3 klyva gasdermin E (GSDME) för att inducera PCD17,18 och bearbetar också GSDMD till en inaktiv form40. Vidare har kaspas-8-rekrytering till inflammasomkomplexet observerats 39,40,41,42,43,44,45, och kaspas-8 är en nyckelregulator för kanonisk och icke-kanonisk inflammasomaktivering 39. Det finns också överlappande och redundanta roller för kaspas-8 och kaspas-1 vid många inflammatoriska tillstånd, och medfödd immun-PCD som kännetecknas av aktivering av pyroptotiska, apoptotiska och nekrototiska komponenter förekommer över sjukdomsspektrumet 39,46,47,48,49,50.

Baserat på denna överhörning mellan inflammatoriska och apoptotiska kaspaser identifierades en viktig lucka i den mekanistiska förståelsen av medfödd immunitet och PCD, vilket ledde till upptäckten av PANoptos. PANoptos är en unik form av III-PCD som aktiveras som svar på patogener, PAMPs, DAMPs och förändringar i homeostas och regleras av PANoptosomer – mångfacetterade makromolekylära komplex som integrerar komponenter från andra celldödsvägar 44,50,51,52,53,54,55 . De totala biologiska effekterna vid PANoptos kan inte enskilt förklaras av pyroptos, apoptos eller nekroptos enbart 3,4,35,36,39,46,47,48, eftersom PANoptos kännetecknas av aktivering av multipla kaspaser, inklusive kaspas-1, kaspas-11, kaspas-8, kaspas-9, kaspas-3 och/eller kaspas-7, beroende på sammanhanget: 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . PANoptos har blivit alltmer inblandad i infektiösa och inflammatoriska sjukdomar, liksom i cancer och cancerterapier 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.

Med tanke på den viktiga rollen av kaspaser över celldödsvägar, inklusive i apoptos, pyroptos, nekrotos och PANoptos, är det viktigt att utveckla tekniker för att karakterisera deras aktivering och förstå PCD-vägarnas fulla komplexitet. Protokollet här beskriver en metod för att stimulera celler och mäta efterföljande aktivering av kaspaser (figur 1). Denna metod utnyttjar den proteolytiska klyvningen av kaspaser, som i allmänhet krävs för deras aktivering, som ett sätt att studera dem. Genom western blotting kan proteinstorlekarna bestämmas, vilket möjliggör tydlig visualisering och differentiering av inaktiva pro-kaspaser och deras aktiverade, klyvda former.

De största fördelarna med detta protokoll är 1) dess förmåga att bedöma aktiveringen av flera kaspaser parallellt från en enda population av endogena celler för att mer exakt bestämma PCD-aktivering och 2) användningen av relativt enkla laboratorietekniker som inte kräver omfattande utbildning eller dyr utrustning. Tidigare protokoll har använt western blotting, fluorescerande reportrar eller antikroppsfärgning för att övervaka kaspasaktivering i odlingssupernatanter, cell- och vävnadslysater, hela celler via mikroskopi och in vivo 67,68,69,70,71, men dessa tekniker övervakar i allmänhet bara en eller två kaspaser i ett prov. Dessutom, medan syntetiska peptidsubstrat innehållande kaspasklyvningsställen som fluorescerar vid klyvning har använts för att övervaka kaspasaktivering i cell- eller vävnadslysat69, kan dessa substrat ofta klyvas av mer än en kaspas, vilket gör det svårt att bestämma den specifika aktiveringen av enskilda kaspaser i detta system. Dessutom tillåter användningen av västerländsk blotting snarare än användningen av fluorescerande reportrar eller andra taggbaserade metoder forskare att använda endogena celler snarare än att skapa specifika cellinjer med reportergener. Det finns flera fördelar med att använda endogena celler, inklusive det faktum att många odödliga cellinjer har brist på nyckelcelldödsmolekyler72,73, vilket kan påverka resultaten. Dessutom möjliggör användning av endogena celler utvärdering av olika celltyper, såsom makrofager, epitelceller och endotelceller, snarare än en enda härstamning. Western blotting är också en relativt enkel och kostnadseffektiv teknik som kan utföras i laboratorier runt om i världen utan behov av stor, dyr utrustning eller komplicerade inställningar.

Detta protokoll är allmänt tillämpligt över biologi för att förstå både celldödsberoende och celldödsoberoende funktioner hos caspaser, inklusive deras byggnadsställningsroller och funktioner i andra inflammatoriska signalvägar74. Att tillämpa denna metod möjliggör ett enhetligt tillvägagångssätt i studien av medfödda immun-PCD-vägar och inflammatorisk signalering över sjukdomar och tillstånd, och detta protokoll kan användas för att identifiera kritiska regleringsprocesser och mekanistiska kopplingar som kommer att informera utvecklingen av framtida terapeutiska strategier.

Protocol

Djurens användning och procedurer godkändes av St. Jude Children’s Research Hospital Committee on the Use and Care of Animals. 1. Förbereda lösningarna Förbered L929-konditionerade medier.Platta 1 × 106 L929-celler (se Materialtabell) i en 182 cm2 vävnadsodlingskolv innehållande 50 ml L929-odlingsmedium (se tabell 1 för beredning av mediet). Odla cellerna i en fuktad inkubator vid 37 …

Representative Results

PANoptos har observerats som svar på många bakteriella, virala och svampinfektioner och andra inflammatoriska stimuli, liksom i cancerceller 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 <s…

Discussion

Övervakning av kaspasklyvning och aktivering ger en av de mest omfattande bilderna av medfödd immun-PCD-aktivering som en del av det medfödda immunsvaret. Protokollet som beskrivs här visar en strategi för att övervaka kaspasaktivering som svar på IAV-, HSV1- och F. novicida-infektioner och den sterila utlösaren LPS + ATP, men många andra stimuli kan inducera PCD och kan användas i denna metod, vilket har visats i flera publikationer 44,48,49,50,51,52,53,54,56<…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar medlemmarna i Kanneganti-labbet för deras kommentarer och förslag, och vi tackar J. Gullett, PhD, för vetenskapligt redigeringsstöd. Arbetet i vårt laboratorium stöds av National Institutes of Health (NIH) bidrag AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 och CA253095 (till T.-D.K.) och av American Lebanese Syrian Associated Charities (till T.-D.K.). Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health.

Materials

0.45 μm filter Millipore SCHVU05RE
10 mL syringe BD Biosciences 309604
12% polyacrylamide gel with 10 wells  Bio-Rad 4561043
12-well plate  Corning 07-200-82
18 G needle  BD Biosciences 305195
25 G needle  BD Biosciences 305122
50 mL tube  Fisher Scientific 50-809-218
70 μm cell strainer  Corning 431751
150 mm tissue culture dishes Corning 430597
182-cm2 tissue culture flask Genesee Scientific 25-211
Accessory white trans tray Cytiva 29-0834-18
Anti–caspase-1 antibody AdipoGen AG-20B-0042-C100
Anti–caspase-11 antibody Novus Biologicals NB120-10454
Anti–caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9662
Anti–caspase-7 antibody Cell Signaling Technology 9492
Anti–caspase-8 antibody Cell Signaling Technology 4927
Anti–caspase-9 antibody Cell Signaling Technology 9504
Anti–cleaved caspase-3 antibody  Cell Signaling Technology 9661
Anti–cleaved caspase-7 antibody  Cell Signaling Technology 9491
Anti–cleaved caspase-8 antibody  Cell Signaling Technology 8592
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 315-035-047
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-047
Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 112-035-003
Anti–β-Actin antibody (C4) HRP Santa Cruz sc-47778 HRP
ATP InvivoGen tlrl-atpl
BBL Trypticase Soy Broth BD Biosciences 211768
Bead bath Chemglass Life Sciences CLS-4598-009
Biophotometer D30 Eppendorf 6133000010
BME Sigma M6250
Bromophenol blue  Sigma BO126
Cell scrapers CellTreat Scientific Products 229315
Chemiluminescence imager (Amersham 600)  Cytiva 29083461
CO2 chamber VetEquip 901703
Cuvettes Fisher Scientific 14-955-129
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 221S
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995-073
DTT Sigma 43815
Eelectrophoresis apparatus  Bio-Rad 1658004
Ethanol Pharmco 111000200
Fetal bovine serum  Biowest S1620
Filter paper Bio-Rad 1703965
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Francisella novicida (U112 strain) BEI Resources NR-13
Gel releaser  Bio-Rad 1653320
Gentamycin Gibco 15750060
Glycerol Sigma G7893
Glycine Sigma G8898
HCl Sigma H9892
Heat block Fisher Scientific 23-043-160
Herpes simplex virus 1 (HF strain) ATCC VR-260
High glucose DMEM  Sigma D6171
Human anti–caspase-1 antibody R&D Systems MAB6215
Human anti–caspase-8 antibody Enzo ALX-804-242
Humidified incubator  Thermo Fisher Scientific 51026282
Image analysis software ImageJ v1.53a
IMDM Thermo Fisher Scientific 12440-053
Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])  constructed per Hoffmann et al.
L929 cells ATCC CCL-1 cell line for creating L929-conditioned media
L-cysteine  Thermo Fisher Scientific BP376-100
Luminata Forte Western HRP substrate Millipore WBLUF0500 standard-sensitivity HRP substrate
MDCK cells ATCC CCL-34 cell line for determining IAV viral titer
Methanol Sigma 322415
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002401
Non-essential amino acids  Gibco 11140050
Nonfat dried milk powder Kroger
NP-40 solution  Sigma 492016
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023
Penicillin and streptomycin  Sigma P4333
Petri dish Fisher Scientific 07-202-011
PhosSTOP Roche PHOSS-RO
Power source  Bio-Rad 164-5052
Protease inhibitor tablet Sigma S8820
PVDF membrane  Millipore IPVH00010
Rocking shaker Labnet S2035-E
SDS Sigma L3771
Sodium chloride  Sigma S9888
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Sodium hydroxide Sigma 72068
Sodium pyruvate  Gibco 11360-070
Square Petri dish Fisher Scientific FB0875711A
Stripping buffer Thermo Fisher Scientific 21059
Super Signal Femto HRP substrate Thermo Fisher Scientific 34580 high-sensitivity HRP substrate
Tabletop centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004524
Trans-Blot semi-dry system  Bio-Rad 170-3940
Tris Sigma TRIS-RO
Tween 20  Sigma P1379
Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 InvivoGen tlrl-3pelps
Vero cells ATCC CCL-81 cell line for determining HSV1 viral titer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alnemri, E. S., et al. Human ICE/CED-3 protease nomenclature. Cell. 87 (2), 171 (1996).
  2. Man, S. M., Kanneganti, T. D. Converging roles of caspases in inflammasome activation, cell death and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 16 (1), 7-21 (2016).
  3. Gullett, J. M., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. D. It’s all in the PAN: Crosstalk, plasticity, redundancies, switches, and interconnectedness encompassed by PANoptosis underlying the totality of cell death-associated biological effects. Cells. 11 (9), 1495 (2022).
  4. Pandian, N., Kanneganti, T. D. PANoptosis: A unique innate immune inflammatory cell death modality. Journal of Immunology. 209 (9), 1625-1633 (2022).
  5. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death & Differentiation. 25 (3), 486-541 (2018).
  6. Shi, Y. Caspase activation: Revisiting the induced proximity model. Cell. 117 (7), 855-858 (2004).
  7. Galluzzi, L., Lopez-Soto, A., Kumar, S., Kroemer, G. Caspases connect cell-death signaling to organismal homeostasis. Immunity. 44 (2), 221-231 (2016).
  8. Fernandes-Alnemri, T., Litwack, G., Alnemri, E. S. CPP32, a novel human apoptotic protein with homology to Caenorhabditis elegans cell death protein Ced-3 and mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 30761-30764 (1994).
  9. Tewari, M., et al. Yama/CPP32 beta, a mammalian homolog of CED-3, is a CrmA-inhibitable protease that cleaves the death substrate poly(ADP-ribose) polymerase. Cell. 81 (5), 801-809 (1995).
  10. Nicholson, D. W., et al. Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis. Nature. 376 (6535), 37-43 (1995).
  11. Stennicke, H. R., et al. Pro-caspase-3 is a major physiologic target of caspase-8. Journal of Biological Chemistry. 273 (42), 27084-27090 (1998).
  12. Twiddy, D., Cohen, G. M., Macfarlane, M., Cain, K. Caspase-7 is directly activated by the approximately 700-kDa apoptosome complex and is released as a stable XIAP-caspase-7 approximately 200-kDa complex. Journal of Biological Chemistry. 281 (7), 3876-3888 (2006).
  13. Kesavardhana, S., Malireddi, R. K. S., Kanneganti, T. D. Caspases in cell death, inflammation, and pyroptosis. Annual Reviews of Immunology. 38, 567-595 (2020).
  14. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26 (4), 239-257 (1972).
  15. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: Controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (3), 231-241 (2008).
  16. Morioka, S., Maueröder, C., Ravichandran, K. S. Living on the edge: Efferocytosis at the interface of homeostasis and pathology. Immunity. 50 (5), 1149-1162 (2019).
  17. Wang, Y., et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).
  18. Rogers, C., et al. Cleavage of DFNA5 by caspase-3 during apoptosis mediates progression to secondary necrotic/pyroptotic cell death. Nature Communications. 8, 14128 (2017).
  19. Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
  20. Shi, J., Gao, W., Shao, F. Pyroptosis: Gasdermin-mediated programmed necrotic cell death. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 245-254 (2017).
  21. Sborgi, L., et al. GSDMD membrane pore formation constitutes the mechanism of pyroptotic cell death. EMBO Journal. 35 (16), 1766-1778 (2016).
  22. Aglietti, R. A., et al. GsdmD p30 elicited by caspase-11 during pyroptosis forms pores in membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7858-7863 (2016).
  23. Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341 (6151), 1250-1253 (2013).
  24. Kayagaki, N., et al. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).
  25. Shi, J., et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS. Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).
  26. Lamkanfi, M., et al. Targeted peptidecentric proteomics reveals caspase-7 as a substrate of the caspase-1 inflammasomes. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (12), 2350-2363 (2008).
  27. Kalai, M., et al. Tipping the balance between necrosis and apoptosis in human and murine cells treated with interferon and dsRNA. Cell Death & Differentiation. 9 (9), 981-994 (2002).
  28. Li, C., et al. Development of atopic dermatitis-like skin disease from the chronic loss of epidermal caspase-8. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22249-22254 (2010).
  29. Kovalenko, A., et al. Caspase-8 deficiency in epidermal keratinocytes triggers an inflammatory skin disease. Journal of Experimental Medicine. 206 (10), 2161-2177 (2009).
  30. Kang, T. B., et al. Caspase-8 serves both apoptotic and nonapoptotic roles. Journal of Immunology. 173 (5), 2976-2984 (2004).
  31. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
  32. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
  33. Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
  34. Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
  35. Hitomi, J., et al. Identification of a molecular signaling network that regulates a cellular necrotic cell death pathway. Cell. 135 (7), 1311-1323 (2008).
  36. Malireddi, R. K., Ippagunta, S., Lamkanfi, M., Kanneganti, T. D. Cutting edge: Proteolytic inactivation of poly(ADP-ribose) polymerase 1 by the Nlrp3 and Nlrc4 inflammasomes. Journal of Immunology. 185 (6), 3127-3130 (2010).
  37. Tsuchiya, K., et al. Caspase-1 initiates apoptosis in the absence of gasdermin D. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  38. Taabazuing, C. Y., Okondo, M. C., Bachovchin, D. A. Pyroptosis and apoptosis pathways engage in bidirectional crosstalk in monocytes and macrophages. Cell Chemical Biology. 24 (4), 507-514 (2017).
  39. Gurung, P., et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes. Journal of Immunology. 192 (4), 1835-1846 (2014).
  40. Man, S. M., et al. Inflammasome activation causes dual recruitment of NLRC4 and NLRP3 to the same macromolecular complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7403-7408 (2014).
  41. Man, S. M., et al. Salmonella infection induces recruitment of Caspase-8 to the inflammasome to modulate IL-1beta production. Journal of Immunology. 191 (10), 5239-5246 (2013).
  42. Van Opdenbosch, N., et al. Caspase-1 engagement and TLR-induced c-FLIP expression suppress ASC/caspase-8-dependent apoptosis by inflammasome sensors NLRP1b and NLRC4. Cell Reports. 21 (12), 3427-3444 (2017).
  43. Pierini, R., et al. AIM2/ASC triggers caspase-8-dependent apoptosis in Francisella-infected caspase-1-deficient macrophages. Cell Death & Differentiation. 19 (10), 1709-1721 (2012).
  44. Lee, S., et al. AIM2 forms a complex with pyrin and ZBP1 to drive PANoptosis and host defence. Nature. 597 (7876), 415-419 (2021).
  45. Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death & Differentiation. 20 (9), 1149-1160 (2013).
  46. Lukens, J. R., et al. Dietary modulation of the microbiome affects autoinflammatory disease. Nature. 516 (7530), 246-249 (2014).
  47. Gurung, P., Burton, A., Kanneganti, T. D. NLRP3 inflammasome plays a redundant role with caspase 8 to promote IL-1beta-mediated osteomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4452-4457 (2016).
  48. Kuriakose, T., et al. ZBP1/DAI is an innate sensor of influenza virus triggering the NLRP3 inflammasome and programmed cell death pathways. Science Immunology. 1 (2), (2016).
  49. Malireddi, R. K. S., et al. TAK1 restricts spontaneous NLRP3 activation and cell death to control myeloid proliferation. Journal of Experimental Medicine. 215 (4), 1023-1034 (2018).
  50. Malireddi, R. K. S., et al. Innate immune priming in the absence of TAK1 drives RIPK1 kinase activity-independent pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and inflammatory disease. Journal of Experimental Medicine. 217 (3), (2020).
  51. Christgen, S., et al. Identification of the PANoptosome: A molecular platform triggering pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 237 (2020).
  52. Malireddi, R. K. S., et al. RIPK1 distinctly regulates Yersinia-induced inflammatory cell death, PANoptosis. Immunohorizons. 4 (12), 789-796 (2020).
  53. Zheng, M., Karki, R., Vogel, P., Kanneganti, T. D. Caspase-6 is a key regulator of innate immunity, inflammasome activation, and host defense. Cell. 181 (3), 674-687 (2020).
  54. Karki, R., et al. ADAR1 restricts ZBP1-mediated immune response and PANoptosis to promote tumorigenesis. Cell Reports. 37 (3), 109858 (2021).
  55. Wang, Y., et al. Single cell analysis of PANoptosome cell death complexes through an expansion microscopy method. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (10), 531 (2022).
  56. Malireddi, R. K. S., et al. Inflammatory cell death, PANoptosis, mediated by cytokines in diverse cancer lineages inhibits tumor growth. Immunohorizons. 5 (7), 568-580 (2021).
  57. Kesavardhana, S., et al. The Zα2 domain of ZBP1 is a molecular switch regulating influenza-induced PANoptosis and perinatal lethality during development. Journal of Biological Chemistry. 295 (24), 8325-8330 (2020).
  58. Banoth, B., et al. ZBP1 promotes fungi-induced inflammasome activation and pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Journal of Biological Chemistry. 295 (52), 18276-18283 (2020).
  59. Karki, R., et al. Interferon regulatory factor 1 regulates PANoptosis to prevent colorectal cancer. JCI Insight. 5 (12), 136720 (2020).
  60. Zheng, M., et al. Impaired NLRP3 inflammasome activation/pyroptosis leads to robust inflammatory cell death via caspase-8/RIPK3 during coronavirus infection. Journal of Biological Chemistry. 295 (41), 14040-14052 (2020).
  61. Karki, R., et al. Synergism of TNF-α and IFN-γ triggers inflammatory cell death, tissue damage, and mortality in SARS-CoV-2 infection and cytokine shock syndromes. Cell. 184 (1), 149-168 (2021).
  62. Karki, R., et al. ZBP1-dependent inflammatory cell death, PANoptosis, and cytokine storm disrupt IFN therapeutic efficacy during coronavirus infection. Science Immunology. 7 (74), (2022).
  63. Jiang, W., Deng, Z., Dai, X., Zhao, W. PANoptosis: A new insight into oral infectious diseases. Frontiers in Immunology. 12, 789610 (2021).
  64. Chi, D., et al. Real-time induction of macrophage apoptosis, pyroptosis, and necroptosis by Enterococcus faecalis OG1RF and two root canal isolated strains. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 720147 (2021).
  65. Lin, J. F., et al. Phosphorylated NFS1 weakens oxaliplatin-based chemosensitivity of colorectal cancer by preventing PANoptosis. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 54 (2022).
  66. Song, M., et al. Self-assembled polymeric nanocarrier-mediated co-delivery of metformin and doxorubicin for melanoma therapy. Drug Delivery. 28 (1), 594-606 (2021).
  67. Boucher, D., Chan, A., Ross, C., Schroder, K. Quantifying caspase-1 activity in murine macrophages. Methods in Molecular Biology. 1725, 163-176 (2018).
  68. Boucher, D., Duclos, C., Denault, J. B. General in vitro caspase assay procedures. Methods in Molecular Biology. 1133, 3-39 (2014).
  69. Kaushal, V., Herzog, C., Haun, R. S., Kaushal, G. P. Caspase protocols in mice. Methods in Molecular Biology. 1133, 141-154 (2014).
  70. Swacha, P., Gekara, N. O., Erttmann, S. F. Biochemical and microscopic analysis of inflammasome complex formation. Methods in Enzymology. 625, 287-298 (2019).
  71. Talley, S., et al. A caspase-1 biosensor to monitor the progression of inflammation in vivo. Journal of Immunology. 203 (9), 2497-2507 (2019).
  72. Pelegrin, P., Barroso-Gutierrez, C., Surprenant, A. P2X7 receptor differentially couples to distinct release pathways for IL-1beta in mouse macrophage. Journal of Immunology. 180 (11), 7147-7157 (2008).
  73. Yu, J. W., et al. Cryopyrin and pyrin activate caspase-1, but not NF-kappaB, via ASC oligomerization. Cell Death & Differentiation. 13 (2), 236-249 (2006).
  74. Henry, C. M., Martin, S. J. Caspase-8 acts in a non-enzymatic role as a scaffold for assembly of a pro-inflammatory "FADDosome" complex upon TRAIL stimulation. Molecular Cell. 65 (4), 715-729 (2017).
  75. Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y., Hobom, G., Webster, R. G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6108-6113 (2000).
  76. Simpson, R. J. Homogenization of mammalian tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).

Tags

Caspase ActivationInnate Immune Cell DeathDisease MechanismsTherapeutic StrategiesCell Death ProcessesBone Marrow-derived Macrophages (BMDMs)Influenza A VirusProtein CollectionSDS-PAGECaspase Lysis Buffer
check_url/fr/64308?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Han, J., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death. J. Vis. Exp. (191), e64308, doi:10.3791/64308 (2023).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image