L’objectif ici est de définir un protocole pour étudier les mécanismes de la dysbiose dans les maladies cardiovasculaires. Cet article explique comment collecter et transplanter de manière aseptique des échantillons fécaux murins, isoler les intestins et utiliser la méthode « Swiss-roll », suivie de techniques d’immunomarquage pour interroger les changements dans le tractus gastro-intestinal.
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Article de méthode
Isolement fécal murin et transplantation de microbiote
Dans cet article
Résumé
Résumé
La dysbiose du microbiote intestinal joue un rôle dans la physiopathologie des troubles cardiovasculaires et métaboliques, mais les mécanismes ne sont pas bien compris. La transplantation de microbiote fécal (TMF) est une approche précieuse pour délimiter un rôle direct du microbiote total ou des espèces isolées dans la physiopathologie de la maladie. C’est une option de traitement sûre pour les patients atteints d’une infection récurrente à Clostridium difficile . Des études précliniques démontrent que la manipulation du microbiote intestinal est un outil utile pour étudier le lien mécaniste entre dysbiose et maladie. La transplantation de microbiote fécal peut aider à élucider de nouvelles thérapies ciblant le microbiote intestinal pour la gestion et le traitement des maladies cardiométaboliques. Malgré un taux de réussite élevé chez les rongeurs, il reste des changements translationnels associés à la transplantation. L’objectif ici est de fournir des conseils pour étudier les effets du microbiome intestinal dans les maladies cardiovasculaires expérimentales. Dans cette étude, un protocole détaillé pour la collecte, la manipulation, le traitement et la transplantation du microbiote fécal dans les études sur les murins est décrit. Les étapes de collecte et de traitement sont décrites pour les donneurs humains et les rongeurs. Enfin, nous décrivons l’utilisation d’une combinaison des techniques de roulage suisse et d’immunomarquage pour évaluer la morphologie spécifique de l’intestin et les changements d’intégrité dans les maladies cardiovasculaires et les mécanismes connexes du microbiote intestinal.
Introduction
Les troubles cardiométaboliques, y compris les maladies cardiaques et les accidents vasculaires cérébraux, sont les principales causes mondiales de décès1. L’inactivité physique, une mauvaise alimentation, l’âge avancé et la génétique modulent la physiopathologie de ces troubles. L’accumulation de preuves soutient le concept selon lequel le microbiote intestinal affecte les troubles cardiovasculaires et métaboliques, y comprisle diabète de type 2, l’obésité3 et l’hypertension4, qui pourraient être essentiels au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour ces ma....
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Protocole
Le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Vanderbilt a approuvé toutes les procédures décrites dans ce manuscrit. Les souris mâles C57B1/6 âgées de 3 mois, achetées au Jackson Laboratory, ont été hébergées et soignées conformément au Guide de soin et d’utilisation des animaux de laboratoire.
1. Collecte, entreposage et traitement d’échantillons fécaux humains
- Prélever un échantillon de selles à l’aide d’un contenant stérile si le sujet est à la clinique. Réfrigérer les échantillons de selles à 4 °C dans les 36 heures suivant le prélèvement jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour le ....
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Résultats
Les étapes décrites ci-dessus sont résumées à la figure 1. Le contenu des cæcaux de souris ou les excréments humains sont remis en suspension dans une solution saline stérile pour préparer une suspension à donner à des souris exemptes de germes (100 μL) par gavage, d’abord pendant 3 jours consécutifs, puis une fois tous les 3 jours. À la fin du protocole, la pression artérielle est mesurée par la méthode du brassard de queue, les souris sont euthanasiées et les tissus sont prélevés pour éval.......
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Discussion
Une approche utile pour étudier le rôle causal du microbiote intestinal dans les maladies cardiovasculaires et métaboliques consiste à transférer le microbiote total ou certaines espèces d’intérêt chez des souris exemptes de germes. Ici, nous décrivons des protocoles pour collecter des échantillons fécaux chez l’homme et des souris logées de manière conventionnelle dans des souris exemptes de germes afin d’étudier le rôle du microbiote intestinal dans les troubles hypertensifs.
Chez la souris,.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d’intérêts, financier ou autre, n’est déclaré par les auteurs.
Remerciements
Cette étude a été financée par la subvention UL1TR002243 (à A.K.) du National Center for Advancing Translational Sciences; American Heart Association Grant POST903428 (à J.A.I.); et les subventions K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 du National Heart, Lung, and Blood Institute (à A.K.) et la subvention 1P01HL116263 des NIH (à V.K.). La figure 1 a été créée à l’aide de Biorender.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Chambre anaérobie | COY | 7150220 | |
| Apolipoprotéine AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Ciseaux à artère - Pointe de balle | Outils scientifiques fins | 14086-09 | |
| Solution d’eau de Javel | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Albumine sérique bovine | Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 | anticorps ThermoFisher | ; 14-0032-82 | |
| Anticorps monoclonal CD68 | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrifugeuse | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| Moniteur à haut débit CODA | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Flacons cryogéniques | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Pipettes de transfert graduées jetables | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Seringues jetables | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Aiguille d’alimentation | Fine Science Tools | 18061-38 | |
| Feuille de papier filtre | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formol (10 %) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| Régime riche en sel | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Mini-pompes osmotiques | Alzet | ; MODÈLE 2002 | |
| Stylo PAP | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Boîte de Pétri | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pointes de pipette | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Saline sérile tamponnée au phosphate | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
| Spatule intelligente | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Dispositif de collecte des tabourets | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 | |
| Varimix plateforme à bascule | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Mélangeur Vortex | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xylène | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
Références
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: a report From the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254(2021).
- Wu, H., et al. The gut microbiota in prediabetes and diabetes:....
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Réimpressions et autorisations
