الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية: التمايز عن الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ومقايسة البلعمة في الخلايا الحية في المختبر باستخدام المشبك البشري
Summary
يصف هذا البروتوكول عملية تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs) إلى خلايا تشبه الخلايا الدبقية الصغيرة لإجراء التجارب في المختبر . نقوم أيضا بتضمين إجراء مفصل لتوليد المشابك البشرية من الخلايا العصبية الحركية السفلية المشتقة من iPSC والتي يمكن استخدامها كركيزة لفحوصات البلعمة في المختبر باستخدام أنظمة تصوير الخلايا الحية.
Abstract
الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية المقيمة من أصل نخاعي تحافظ على التوازن في البيئة الدقيقة للدماغ وأصبحت لاعبا رئيسيا في العديد من الأمراض العصبية. تمثل دراسة الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية في مجال الصحة والمرض تحديا بسبب الإمداد المحدود للغاية بالخلايا البشرية. يمكن استخدام الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) المشتقة من الأفراد البشريين للتحايل على هذا الحاجز. هنا ، يتم توضيح كيفية التمييز بين iPSCs البشرية إلى خلايا تشبه الخلايا الدبقية الصغيرة (iMGs) للتجارب في المختبر . تظهر هذه الخلايا الجذعية المستغلة الخصائص المتوقعة والفسيولوجية للخلايا الدبقية الصغيرة، بما في ذلك التشكل الشبيه بالخلايا الدبقية الصغيرة، والتعبير عن العلامات المناسبة، والبلعمة النشطة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير وثائق لعزل ووضع العلامات على ركائز متشابكة مشتقة من الخلايا العصبية الحركية السفلية المشتقة من iPSC البشرية (i3LMNs). يتم استخدام اختبار التصوير الطولي للخلايا الحية لمراقبة ابتلاع المشابك البشرية الموسومة بصبغة حساسة للأس الهيدروجيني ، مما يسمح بإجراء تحقيقات في قدرة البلعمة في iMG. تنطبق البروتوكولات الموصوفة هنا على نطاق واسع على المجالات المختلفة التي تبحث في بيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية ومساهمة الخلايا الدبقية الصغيرة في المرض.
Introduction
الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية المقيمة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) وتلعب دورا مهما في تطوير الجهاز العصبي المركزي. الخلايا الدبقية الصغيرة مهمة أيضا في دماغ البالغين للحفاظ على التوازن والاستجابة بنشاط لعمليات الصدمات والأمراض. تظهر الأدلة التراكمية أن الخلايا الدبقية الصغيرة هي المساهمين الرئيسيين في التسبب في العديد من الأمراض العصبية النمائية والتنكسية العصبية 1,2. على الرغم من أن المعرفة الحالية حول بيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة قد تم اشتقاقها في الغالب من نماذج الفئران ، فقد أوضحت الدراسات الحديثة اختلافات مهمة بين الفئران والخلايا الدبقية الصغيرة البشرية ، مما يؤكد الحاجة إلى تطوير تقنيات لدراسة الوظائف الوراثية والبيولوجية للخلايا الدبقية الصغيرة البشرية 3,4. يمكن أن يؤدي عزل الخلايا الدبقية الصغيرة من الأنسجة الأولية المشرحة إلى تعديل خصائص الخلايا الدبقية الصغيرةبشدة 5 ، مما قد يؤدي إلى نتائج مربكة تم الحصول عليها باستخدام هذه الخلايا. الهدف العام من هذه الطريقة هو التمييز بين iPSCs البشرية إلى iMGs ، وبالتالي توفير نظام زراعة الخلايا لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية في ظل الظروف القاعدية. علاوة على ذلك ، يتم تضمين اختبار البلعمة باستخدام نظام نموذج بشري بالكامل هنا كوسيلة لدراسة وظائف iMGs ، كإجراء لمراقبة الجودة وتقييم الخلل الوظيفي في iMG في سياق المرض.
ظهرت مؤخرا بروتوكولات متعددة لتمايز الخلايا الدبقية الصغيرة من iPSCs في الأدبيات6،7،8،9،10. تشمل العيوب المحتملة لبعض البروتوكولات فترات التمايز الممتدة أو الطويلة ، وإضافة عوامل نمو متعددة ، و / أو الإجراءات التجريبية المعقدة6،9،10. هنا ، يتم توضيح طريقة تمايز “سهلة الاستخدام” تلخص جوانب تطور الخلايا الدبقية الصغيرة من خلال تمايز iPSCs إلى خلايا سلائف تسمى سلائف البلاعم البدائية (PMPs)7,11. يتم إنشاء PMPs كما هو موضح سابقا ، مع بعض التحسينات المقدمة هنا12. تحاكي PMPs الضامة المشتقة من كيس الصفار المستقل عن MYB ، والتي تؤدي إلى ظهور الخلايا الدبقية الصغيرة أثناء التطور الجنيني عن طريق غزو الدماغ قبل إغلاق حاجز الدم في الدماغ13. للتمييز النهائي بين PMPs و iMGs ، استخدمنا طريقة زراعة أحادية سريعة ومبسطة تعتمد على بروتوكولات Haenseler et al. و Brownjohn et al. ، مع بعض التعديلات لتوليد طريقة تمايز الخلايا الدبقية الصغيرة الفعالة التي تعبر فيها iMGs بقوة عن علامات الخلايا الدبقية الصغيرةالمخصبة 7,8. يمكن استنساخ طريقة التمايز هذه في المختبرات ذات الخبرة في ثقافة iPSCs ومع أهداف بحثية تهدف إلى دراسة بيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام نظام نموذج بشري.
تمثل الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من iPSC مصدرا ذا صلة بيولوجيا للخلايا الدبقية الصغيرة البشرية لإجراء التجارب في المختبر وهي أداة مهمة للتحقيق في الوظائف الكنسية للخلايا الدبقية الصغيرة ، بما في ذلك البلعمة. الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا البلعمية المهنية في الدماغ والجهاز العصبي المركزي، حيث تزيل حطام الخلايا، والبروتينات المجمعة، والمايلين14 المتحلل. تعمل الخلايا الدبقية الصغيرة أيضا في إعادة تشكيل متشابك عن طريق ابتلاع نقاط الاشتباك العصبي وفي الدفاع ضد الالتهابات الخارجية من خلال البلعمة من مسببات الأمراض15,16. في هذا البروتوكول ، يتم تقييم البلعمة بواسطة iMGs باستخدام المشابك البشرية كمواد لابتلاع iMG. تحقيقا لهذه الغاية ، تم وصف وصف لعزل التشابك العصبي المشتق من الإنسان i3LMNs. يتم تمييز المشابك البشرية المشتقة من i3LMN بصبغة حساسة للأس الهيدروجيني تسمح بتحديد كمية التشابك العصبي المترجمة داخل المقصورات الحمضية أثناء معالجة البلعمة وتدهورها في المختبر. يظهر اختبار البلعمة باستخدام الفحص المجهري للخلايا الحية لمراقبة العملية الديناميكية لابتلاع الخلايا الدبقية الصغيرة في الوقت الفعلي. يضع هذا الفحص الوظيفي أساسا للتحقيق في العيوب المحتملة في البلعمة الدبقية الصغيرة في الصحة والمرض باستخدام نظام بشري كامل.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر بروتوكول التمايز الموصوف هنا طريقة فعالة للحصول على خلايا شبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من iPSC في ~ 6-8 أسابيع بنقاوة عالية وفي عائد كاف لإجراء تجارب التألق المناعي والمقايسات الأخرى التي تتطلب عددا أكبر من الخلايا. وقد أسفر هذا البروتوكول عن 1 × 106 iMGs في أسبوع واحد ، مما ي…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون مايكل وارد على توفير خط WTC11 hNIL iPSC لتمايز الخلايا العصبية الحركية ومختبرات جاكسون لتزويد خط KOLF2.1J WT clone B03 iPSC المستخدم في تمايز الخلايا الدبقية الصغيرة. كما نشكر دوروثي شافر على دعمها أثناء تنفيذ البروتوكولات ، وأنتوني جيامبيتروزي وجون لاندرز لمساعدتهم في نظام التصوير بالخلايا الحية وكذلك هايدن جاد لمساهماته الفنية أثناء المراجعات وجوناثان جونغ لتعاونه في هذه الدراسة. تم دعم هذا العمل من قبل صندوق دان وديان ريتشيو لعلم الأعصاب من كلية الطب UMASS Chan و Angel Fund، Inc.
Materials
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
- Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).
- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
- Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
- Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
- McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
- Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
- Wilgenburg, B. v., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098 (2013).
- Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).
- Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson’s disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).
- Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
- Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).
- Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
- Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
