Abbiamo sviluppato una pipeline di meccano-imaging per studiare le proprietà eterogenee strutturali e meccaniche della placca aterosclerotica. Questa pipeline consente la correlazione dell’angolo predominante locale e della dispersione dell’orientamento delle fibre di collagene, il comportamento di rottura e le impronte digitali della tensione del tessuto fibroso della placca.
La rottura delle placche aterosclerotiche nelle arterie coronarie e carotidi è la causa primaria di eventi cardiovascolari fatali. Tuttavia, la meccanica di rottura del tessuto della placca eterogenea e altamente collagenosa, e come questo sia correlato alla struttura fibrosa del tessuto, non sono ancora noti. Le tubazioni esistenti per studiare la meccanica della placca si limitano ad ottenere solo caratteristiche meccaniche grossolane del tessuto della placca, basate sull’ipotesi di omogeneità strutturale del tessuto. Tuttavia, il tessuto fibroso della placca è strutturalmente eterogeneo, probabilmente principalmente a causa della variazione locale nell’architettura delle fibre di collagene.
La pipeline di meccano-imaging qui descritta è stata sviluppata per studiare le proprietà eterogenee strutturali e meccaniche della placca. In questa pipeline, l’architettura locale del collagene del tessuto è caratterizzata utilizzando la microscopia multifotonica (MPM) con generazione di seconda armonica (SHG) e il comportamento di rottura del tessuto è caratterizzato in condizioni di test di trazione uniassiali utilizzando l’analisi di correlazione digitale delle immagini (DIC). Questa pipeline sperimentale consente la correlazione dell’angolo predominante locale e della dispersione dell’orientamento delle fibre di collagene, il comportamento di rottura e le impronte digitali di deformazione del tessuto fibroso della placca. Le conoscenze acquisite sono fondamentali per comprendere, prevedere e prevenire meglio gli eventi di rottura della placca aterosclerotica.
L’ictus ischemico, spesso innescato dalla rottura della placca aterosclerotica nelle arterie carotidi, è una delle principali cause di mortalità e morbilità in tutto il mondo1. Tuttavia, le attuali strategie di pianificazione del trattamento chirurgico per prevenire l’ictus correlato all’aterosclerosi carotidea non includono la valutazione del rischio di rottura della placca2. Ciò è dovuto principalmente al fatto che i biomarcatori di rischio precedentemente suggeriti, come lo spessore del cappuccio della placca3 e la dimensione del nucleo lipidico4, hanno dimostrato di avere un valore predittivo subottimale per eventi clinici futuri 5,6. Una migliore comprensione della meccanica della placca e dei meccanismi di rottura è necessaria per ottimizzare la valutazione del rischio di rottura della placca e identificare nuovi marcatori di rischio delle placche aterosclerotiche.
La rottura della placca è un evento meccanico locale in cui il tessuto della placca altamente fibroso non riesce a sopportare il carico meccanico esercitato su di esso dalla pressione sanguigna e perde la sua integrità strutturale7. Nonostante ciò, la meccanica dell’evento di rottura della placca e il suo legame con la microstruttura sottostante sono poco conosciuti8. I pochi studi sperimentali che hanno caratterizzato il cedimento tissutale della placca presentano 9,10,11,12,13 proprietà di rottura meccanica grossolana (cioè deformazione e resistenza alla rottura della trazione finale), derivate con l’ipotesi di omogeneità strutturale del tessuto. Tuttavia, il tessuto fibroso della placca è strutturalmente eterogeneo, probabilmente principalmente a causa della variazione locale nell’architettura delle fibre di collagene14. Inoltre, il legame tra le caratteristiche di guasto meccanico del tessuto della placca e l’architettura del collagene è stato studiato solo in un recente studio di Johnston et al. Gli autori hanno mostrato una differenza interplacca nell’orientamento predominante delle fibre e hanno riportato sollecitazioni finali più elevate e ceppi finali inferiori per campioni di cappuccio di placca fibrosa con un orientamento prevalentemente circonferenziale delle fibre15. Tuttavia, lo studio era anche limitato alle proprietà meccaniche e strutturali grossolane.
Per far luce sulle informazioni essenziali sull’architettura locale del collagene e sulle proprietà meccaniche locali del tessuto fibroso della placca, nel presente studio, abbiamo sviluppato una pipeline di meccano-imaging. Questa pipeline ex vivo consente di quantificare la direzione e la dispersione locale delle fibre di collagene, nonché il ceppo di rottura locale. La pipeline prevede l’imaging MPM con SHG per visualizzare le fibre di collagene nel tessuto della placca, nonché test di trazione DIC e uniassiali per quantificare le caratteristiche di rottura del tessuto.
La generazione di microscopia multifotonica della seconda armonica (MPM-SHG) è diventata una tecnica popolare per studiare il collagene nei tessuti biologici16. La tecnica presenta molti vantaggi rispetto ad altre tecniche di imaging del collagene, come l’istologia17, l’imaging del tensore di diffusione (DTI)14 e la diffusione della luce a piccolo angolo (SALS)15. Innanzitutto, l’imaging MPM-SHG non è distruttivo, il che lo rende ideale da combinare con test meccanici18. In secondo luogo, il segnale SHG è specifico per il collagene e quindi non è necessaria alcuna colorazione del tessuto. A causa delle lunghe lunghezze d’onda di eccitazione (vicino infrarosso), la profondità di penetrazione è maggiore rispetto ad altre tecniche di microscopia16. L’alta risoluzione (livello μm) ottenuta con l’imaging SHG consente anche la visualizzazione delle singole fibre. Ciò offre molte possibilità, come la quantificazione locale del numero di fibre di collagene, l’orientamento delle fibre di collagene e la distribuzione19.
La correlazione digitale delle immagini (DIC) combinata con i test meccanici è un metodo ampiamente utilizzato per ottenere proprietà meccaniche locali dei tessuti biologici20. Con DIC, lo spostamento delle macchie applicate sulla superficie del tessuto viene monitorato confrontando le immagini della telecamera ad alta velocità acquisite durante i test meccanici20. Questo metodo di post-elaborazione delle immagini viene utilizzato per stimare le tensioni superficiali a tutto campo del campione20 e può anche essere utilizzato per studiare il comportamento di rottura del tessuto21.
L’attuale studio si è concentrato sullo sviluppo di una pipeline di meccano-imaging per studiare la correlazione tra l’orientamento e la dispersione del collagene locale, le proprietà meccaniche locali e il comportamento di rottura del tessuto fibroso della placca aterosclerotica. Il protocollo qui descritto è innovativo per diversi motivi. In primo luogo, questa è la prima volta che la correlazione delle immagini digitali è stata applicata per misurare la deformazione locale del tessuto della placca fibrosa sotto carico meccanico. In secondo luogo, questo protocollo fornisce le informazioni necessarie per analizzare l’associazione tra il modello di deformazione locale e l’architettura locale del collagene del tessuto fibroso della placca. L’importanza della valutazione locale è sottolineata sia dai dati di ceppo che dai dati sul collagene presentati nella sezione dei risultati, che mostrano la natura eterogenea del tessuto. Pertanto, l’uso di tecniche che consentono la valutazione locale, come quelle utilizzate in questo protocollo, è raccomandato per studi futuri sulle proprietà della placca fibrosa.
La preparazione del campione di prova è tra le fasi critiche di questo protocollo. Le placche carotidei sono principalmente tessuti collagenosi; tuttavia, possono contenere calcificazioni che si ritiene influenzino il comportamento meccanico complessivo della placca36,37. Poiché lo studio si concentra sulla componente fibrosa della placca, le calcificazioni vengono evitate nei campioni di prova utilizzando l’imaging μCT38. Se la μCT non è disponibile, altre tecniche di imaging come la risonanza magnetica o l’OCT39 possono essere prese in considerazione per rilevare le regioni calcificate nella placca. Ottenere campioni di test di tessuto fibroso privi di calcificazioni e di dimensioni sufficientemente grandi da poter essere lavorati per test meccanici può essere un compito impegnativo per le placche che sono fortemente calcificate o contengono calcificazioni disperse. Un altro compito impegnativo nel protocollo è generare un modello di speckle ottimale per la correlazione delle immagini digitali. Il DIC ottimale richiede un rapporto bianco/nero di 50:5028 e macchia le dimensioni da tre a cinque pixel29 per garantire una qualità adeguata. Il mancato rispetto di questi requisiti può comportare misurazioni locali della deformazione imprecise. Infine, mappare la posizione di rottura alle immagini SHG può essere difficile se i punti di riferimento naturali di un tessuto non sono chiari. Per tali campioni, sarà utile l’applicazione di diversi marcatori fiduciali al tessuto prima dell’imaging.
La tecnica MPM-SHG utilizzata nel protocollo attuale è superiore a molte altre tecniche di imaging del collagene, in quanto è una tecnica ad alta risoluzione e non distruttiva con una profondità di penetrazione relativamente grande. Tuttavia, la profondità di penetrazione (<400 μm) di MPM-SHG pone un limite, in quanto non consente di visualizzare l'intero spessore dei campioni di prova, che variava tra 0,5 e 2 mm. In un recente studio con la risonanza magnetica del tensore di diffusione (DT-MRI), abbiamo dimostrato che l'orientamento predominante delle fibre nelle parti più profonde del tessuto della placca può essere diverso da quello nelle parti luminali più superficiali del tessuto14. Pertanto, sono necessari ulteriori studi per studiare l’architettura locale del collagene nelle parti più profonde dei campioni di tessuto a placche fibrose spesse e la sua relazione con la meccanica dei tessuti locali. A tale scopo, è possibile utilizzare l’imaging nel dominio della frequenza spaziale polarizzata (pSFDI). Questa tecnica di imaging ottico recentemente sviluppata ha il potenziale per misurare l’orientamento delle fibre fino a 0,8 mm di profondità nei lembi della valvola mitrale12. Il pSFDI offre anche un’acquisizione rapida, che potrebbe anche facilitare la visualizzazione dell’intera area del campione anziché solo una selezione di piastrelle, come nel caso del protocollo attuale. Un’altra limitazione del protocollo attuale è che è possibile identificare solo la deformazione superficiale. In studi futuri, DIC40 multi-view assistita da specchio o correlazione di volume digitale (DVC)41 possono essere inclusi in questo protocollo per ottenere ulteriori informazioni sui ceppi volumetrici e sotterranei.
L’attuale protocollo sperimentale può essere ulteriormente esteso o modificato in diversi modi per ottenere ulteriori informazioni sulla meccanica della rottura della placca e sulla sua relazione con la microstruttura sottostante. In primo luogo, l’attuale protocollo include prove di trazione uniassiali nella direzione circonferenziale. Questo tipo di prova meccanica è stato scelto poiché la placca presenta prevalentemente un allungamento della trazione nella direzione circonferenziale in vivo. Per una caratterizzazione meccanica più completa, questo protocollo può essere ulteriormente esteso per incorporare test di gonfiaggio, test biassiali o test di trazione uniassiale in direzione longitudinale. In secondo luogo, l’attuale protocollo si concentra solo sull’ottenimento di ceppi locali attraverso DIC. Tuttavia, una visione più completa del comportamento meccanico della placca può essere acquisita includendo anche l’analisi delle sollecitazioni locali nel protocollo, ma ciò richiede la caratterizzazione della rigidità locale. Sebbene attualmente impegnativo, questo può essere ottenuto con tecniche computazionali come il metodo degli elementi finiti inversi 42,43 e il metodo dei campi virtuali44. Oltre all’adattamento sperimentale, alcuni passaggi aggiuntivi di post-elaborazione possono anche essere aggiunti al protocollo corrente. In primo luogo, invece di identificare solo la posizione della rottura, il percorso di propagazione della cricca può essere identificato tramite le immagini della telecamera ad alta velocità ottenute. Questo percorso di propagazione può essere correlato a parametri strutturali e meccanici locali. In secondo luogo, la posizione di inizio della rottura è stata identificata visivamente nel protocollo descritto. Uno studio precedente sui tessuti non biologici ha utilizzato le discontinuità nelle misurazioni della deformazione DIC per rilevare la rottura45. L’applicazione di tale rilevamento automatico della rottura sui tessuti della placca può migliorare l’accuratezza del rilevamento della rottura. Infine, un grande vantaggio di MPM-SHG rispetto ad altre tecniche di imaging del collagene è che visualizza le singole fibre di collagene. Pertanto, i dati ottenuti tramite questo protocollo possono anche essere utilizzati per studiare ulteriori caratteristiche locali del collagene, come il contenuto di collagene.
Questo protocollo può essere utilizzato per fornire una migliore comprensione delle caratteristiche locali del tessuto fibroso della placca, il componente che fallisce meccanicamente nella rottura della placca in vivo. Queste informazioni sono necessarie per stabilire nuovi marcatori di imaging strutturale e funzionale che predicono la rottura della placca nei pazienti. Questi nuovi marcatori sono necessari, poiché i biomarcatori di rischio precedentemente suggeriti hanno dimostrato di avere un valore predittivo subottimale per eventi clinici futuri 5,6. In futuro, OCT e ps-OCT possono eventualmente identificare e quantificare il tessuto fibroso nel sistema arterioso46,47,48. Inoltre, il ceppo è stato considerato un marcatore surrogato per la composizione della placca locale49. Pertanto, le misurazioni del ceppo in vivo 49 potrebbero potenzialmente aiutare nell’identificazione della stabilità della placca nei pazienti. Tuttavia, si dovrebbe fare attenzione a tradurre direttamente i risultati ottenuti nella rottura della placca in vivo. In primo luogo, il tessuto della placca fibrosa subisce un carico più complesso in vivo rispetto al carico di trazione unidirezionale utilizzato de questo protocollo. In secondo luogo, le placche aterosclerotiche sono strutture multicomponente; Le distribuzioni in vivo dello stress e della deformazione nel tessuto fibroso della placca possono essere influenzate dalla presenza e dalla posizione degli altri componenti della placca, come le calcificazioni37.
Questa pipeline di meccano-imaging può anche essere utilizzata per studiare altri tessuti collagenosi. I test meccanici globali e l’imaging strutturale del collagene sono già ampiamente utilizzati per i tessuti biologici. Tuttavia, la valutazione locale delle proprietà di pre-cedimento e fallimento, nonché dell’architettura del collagene, è fondamentale per un’accurata caratterizzazione meccanica di tessuti fibrosi eterogenei. Prevediamo che la struttura di questo nuovo protocollo fornirà ulteriori informazioni sull’interazione tra la microstruttura e la meccanica di diversi tessuti biologici.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione NWO-Vidi (18360).
10 mm extension ring | Thorlabs Inc. | CML10 | |
15 mL tube | VWR | 525-0150 | |
20x APO water immersion objective | Leica | 507701 | |
3D Slicer software | N/A | Version 4.11 | |
50 mL tubes | VWR | 525-0156 | |
Airbrush pistol AB 430- nozzle diameter 0.3 mm | Conrad | 4.01614E+12 | |
Blackout, Nylon Fabric with Polyurethane Coating | Thorlabs | ||
Black tissue dye | Polysciences inc | 24113-2 | |
Camera lens, focal length 50 mm | Thorlabs Inc. | MVL50M1 | |
Camera stand | VWR | 241-0093, 241-7311 | |
Chameleon Ultra multiphoton laser | Coherent | ||
Compressor + air hose | JUN-AIR, Conrad | B07GB9HC62, 4016138577198 | |
Excel | Microsoft | Version 2208 | |
Foam tape double-sided, 1.9 x 150 cm | Pattex | ||
Heating bath | N/A | Custom made | |
High-speed camera + imaging software | Pixelink-Navitar Inc. | PL-D725 | |
Human carotid atherosclerotic plaques (from carotid endarterectomy surgery) | N/A | ||
Image J | National Institute of Health | N/A | |
LAS-AF | Leica | Version 2.3 | Imaging software multiphoton microscope |
LEICA TCS SP5 II | Leica | Microscope used for SHG imaging | |
Lighting system | AMZ instruments | LED-60TB | Used to obtain clear images with the high-speed camera |
MATLAB | MathWorks | Version R2021A | |
MATLAB-based FibLab software | Eindhoven University of Technology | N/A | |
MATLAB-based FOA (Fibre Orientation Analysis) tool | Eindhoven University of Technology | N/A | |
MATLAB-based Ncorr software | Georgia Institute of Technology | Version 1.2 | |
Needles | Emerald | BDAM302986 | |
Petri dish (10 cm diameter) | VWR | BRND452000 | |
Parafilm | VWR | 291-1214 | |
Pasteur Pipettes | VWR | ELKA127-P511-000 | |
Quantum GX2 Micro computed tomography (μCT) scanner + X-ray filter of Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm | PerkinElmer | CLS149276 | |
Ruler | Fine Science Tools | 1800030 | |
Sandpaper (P180) | Conrad | 4.00932E+12 | |
Side cutter | Conrad | 4.25084E+12 | |
Silicon elastomer base and curring agent (Sylgard 184) | VWR | 634165S | |
Tensile tester + software + clamps | N/A | Made in-house using a cylindrical linear actuator (EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.), and a 10 N load cell (LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.) | |
Torque screwdriver | Garant, Hoffman group | 659906 |