Denne protokol beskriver en detaljeret kirurgisk protokol til isolering af flydende tarmlymfe som reaktion på intraduodenale næringsstofinfusioner hos mus. Dette muliggør fysiologisk bestemmelse af total intestinal lipidabsorption og chylomicron syntese og sekretion som reaktion på forskellige eksperimentelle næringsstoffer.
Intestinale lipoproteiner, især triglyceridrige chylomicroner, er en vigtig drivkraft for metabolisme, betændelse og hjerte-kar-sygdomme. Imidlertid er isolering af intestinale lipoproteiner meget vanskeligt in vivo , fordi de først udskilles fra tyndtarmen ind i mesenteriallymfatik. Chylomicron-holdige lymfe tømmer derefter ind i den subklaviske vene fra thoraxkanalen for at levere komponenter af måltidet til hjertet, lungerne og i sidste ende hele kroppens cirkulation. Isolering af naive chylomicroner er umuligt fra blod, da chylomicron triglycerid gennemgår hydrolyse umiddelbart efter interaktion med lipoproteinlipase og andre lipoproteinreceptorer i omløb. Derfor er den oprindelige 2-dages lymfefistleprocedure, beskrevet af Bollman et al. hos rotter, historisk blevet brugt til at isolere frisk mesenterial lymfe, før den kommer ind i thoraxvenen. Denne protokol er blevet forbedret og professionaliseret af Patrick Tso’s laboratorium i de sidste 45 år, hvilket giver mulighed for analyse af disse kritiske lipoproteiner og sekreter fra tarmen. Tso lymfefistelproceduren er nu blevet opdateret og præsenteres her visuelt for første gang. Denne reviderede procedure er en en-dags kirurgisk teknik til installation af et duodenalt fodringsrør, kanylering af mesenteriallymfekanalen og opsamling af lymfe efter et måltid i bevidste mus. De største fordele ved disse nye teknikker omfatter evnen til reproducerbart at indsamle lymfe fra mus (som udnytter kraften i genetiske musemodeller); den reducerede anæstesitid for mus under implantationen af duodenalinfusionsrøret og lymfekanylen; evnen til kontinuerligt at prøve lymfe gennem hele fodrings- og postprandialperioden evnen til kvantitativt at måle hormoner og cytokiner før deres fortynding og enzymatisk hydrolyse i blodet; og evnen til at indsamle store mængder lymfe til isolering af intestinale lipoproteiner. Denne teknik er et kraftfuldt værktøj til direkte og kvantitativ måling af næringsstofabsorption i kosten, intestinal lipoproteinsyntese og chylomicron-sekretion.
Den fysiologiske betydning af det mesenteriske lymfesystem
De mesenteriske lymfatika er blevet beskrevet i en eller anden form siden ~ 300 f.Kr., da Herophilos beskrev leverportalsystemet og alle de “absorberende vener i tarmene”1,2,3,4,5. I mere end 1.700 år efter denne første beskrivelse var et definerende kendetegn ved tarmlymfeknuder tilstedeværelsen af mælkevæske i mesenteriallymfen kort efter et måltid3. Det er nu kendt, at mælkeagtig, chylomicron-holdig lymfe (“chylous” lymfe) ikke dræner ind i portalvenen og leveren, men i stedet bevæger sig gennem cisterna chyli ind i thoraxkanalen og i sidste ende slutter sig til blodet ved venstre subklaviske vene6. På grund af dette anatomiske arrangement rejser chylous lymfe først gennem hjertet og lungerne, før de cirkulerer gennem resten af kroppen. Det betyder, at hjertet og lungerne får et “first-pass” ved sekreterne ind i mesenteriallymfen7.
En vigtig rolle mesenteriske lymfatik er deres transport af kosten lipider fra tyndtarmen 8,9,10. Anatomisk, chylomicrons, intestinale immunceller 11,12,13,14, tarmhormoner 15,16,17,18, antigener 19,20,21, ikke-chylomicron lipofile forbindelser 22,23 , og overskydende væske kommer ind i lactealerne, der ligger under enterocytkældermembranen og koncentreres derefter gennem lymfekapillærerne til mesenteriallymfeknuderne. Der er sandsynligvis mange ukendte mesenteriske lymfekomponenter, herunder metabolitter, antigener, miljøforurenende stoffer, næringsstoffer og signalmolekyler.
Komponenterne i mesenterisk lymfe er ikke blevet systematisk identificeret, hovedsagelig på grund af vanskeligheden ved at isolere mesenterisk lymfe. Adgang til mesenteriallymfe har altid været en alvorlig udfordring, fordi lymfekanalerne er farveløse, og bortset fra efter et fedtholdigt måltid, når de bliver chylous og mælkeagtige, indeholder mesenteriallymferne farveløs lymfevæske 6,8,9,10.
Nuværende og almindelige metoder til isolering af tarmlymfe
Mesenterisk lymfe kan ikke tilgås hos mennesker (undtagen i sjældne og ekstreme tilfælde, hvor der er opstået alvorlige GI-traumer)24. In vivo lymfeopsamling er kirurgisk kompleks og krævende. Den oprindelige 2-dages lymfefistleprocedure blev beskrevet af Bollman et al.25 og er blevet forbedret og professionaliseret af Patrick Tso’s laboratorium i de sidste 45 år 26,27. Lymfefistelproceduren gør det muligt for efterforskere at indsamle flydende lymfe fra bevidste dyr i løbet af en 6 timers duodenal lipidinfusionsperiode.
Lymfefistelmodellen er hovedsageligt blevet brugt til rotter til at måle lymfestrømningshastighed, output af triglycerid og kolesterol (eller andre duodenal-infunderede forbindelser), chylomicronsammensætning og tarmhormonkoncentrationer. I mindre grad kan denne teknik også anvendes til mus, selvom kirurgisk overlevelse og lymfevolumen lider. På grund af vanskelighederne med at se mesenteriske lymfekanaler har historiske metoder inkluderet kanylering af mesenterisk lymfe hos større dyr som mini-grise28, får29, svin30, hunde31 og rotter17. At arbejde med disse større modeller er ressourcekrævende og giver ikke mulighed for studier i knock-in eller knock-out modeller.
Der er også anvendt alternative tilgange. Chylomicrons kan isoleres fra blod i postprandial tilstand (selvom disse vil blive delvist hydrolyseret af plasma lipoprotein lipase)32,33,34,35. Brystkanalen kan også kanyleres, selvom lymfen opsamlet der indeholder en blanding af mesenterisk lymfe og ekstra-intestinal lymfedrænage26,36. In vitro udskiller Caco-2-celler en chylomicron-lignende partikel som reaktion på fedtsyrebehandling, og disse celler kan dyrkes sammen med relevante lymfatiske endotel- eller vaskulære celler37,38. Humane og mus intestinale organoidkulturer har vist sig at behandle apikale lipider og udskille chylomicroner 39,40,41,42. Disse modeller er yderst fordelagtige og muliggør mekanistisk indsigt i tyndtarmens fysiologi, men de kan ikke replikere kompleksiteten, fysiokemiske gradienter eller dynamisk lymfestrøm af in situ mesenteriske lymfatik.
Fordele ved 1 dag mus lymfefistel model præsenteret her
Med hensyn til disse andre metoder til isolering af intestinale lipoproteiner er Tso Lab-lymfefistleteknikken traditionelt blevet betragtet som guldstandardteknikken til måling af absorptionen af næringsstoffer i kosten i mesenterisk lymfe. Denne in vivo-teknik har den fordel, at den fanger vigtige fysiologiske aspekter af lipidabsorption i kosten – forbindelsernes dynamiske udseende i absorptionsperioden, hvilket kræver gentagen prøveudtagning af flydende mesenteriallymfe hos levende dyr med duodenale næringsstoffer. Denne kirurgiske teknik måler også tarmhormoner og cytokiner direkte i deres fysiologiske rum snarere end i blod, hvor de fortyndes og enzymatisk nedbrydes17,43.
Hvis det eksperimentelle spørgsmål kræver en forståelse af lipidsekretionsdynamik eller den dynamiske absorption og metabolisme af enhver hydrofob GI-forbindelse eller lægemiddel, er denne teknik ikke kun passende, men er også den eneste tilgang, der interpolerer bevægelsen af luminalt indhold fra det proksimale til den distale tarm (mave til tyktarm) og fra den apikale til den basolaterale overflade (luminalt indhold gennem enterocyt til lacteals og portalcirkulation). Da denne teknik anvender luminal tilførsel af næringsstoffer gennem det intraduodenale kateter, og fordi den flydende mesenteriske lymfe omdirigeres og opsamles, er hele absorptionsapparatet under eksperimentel kontrol og kan bruges til kvalitativt at vurdere tyndtarmens absorptionsprofiler.
Præsenteret visuelt her for første gang er en større opdatering af Tso Lab-lymfefistelmodellen, som (1) reducerer forsøgstiden til en 1 dags kirurgisk implantations- og eksperimentel indsamlingsperiode; 2) forbedrer museoverlevelse og dyrevelfærd og (3) øger reproducerbarheden af tilgangen i mus for at udnytte kraften i musegenetiske modeller. Denne teknik skal betragtes som en guldstandard for alle eksperimentelle spørgsmål om tarmsekretioner, lipoproteiner eller diætlipidabsorption og er den bedste teknik til high-fidelity-bestemmelse af lipidabsorptionskinetik og chylomicrons.
Den oprindelige 2-dages lymfefistleprocedure blev beskrevet af Bollman et al.25 og praktiseret af Patrick Tso’s laboratorium i de sidste 45 år 26,27. Protokollen, der præsenteres her, er en kraftfuld tilføjelse til denne klassiske, guldstandardmetode til at identificere, kvantificere og forstå tyndtarmens unikke chylousekretioner samt in vivo-dynamikken i næringsstofabsorption og metabolisme i kosten, tarmhormoner og tarmimmunitet.
Fordelene ved denne model inkluderer (1) evnen til kontinuerligt at prøve mesenterisk lymfe gennem hele fodrings- og postprandialperioden snarere end statisk prøveudtagning på et tidspunkt under enten absorption, fordøjelse eller sekretion; 2) måling af tarmhormoner og cytokiner direkte i deres fysiologiske rum i stedet for i blodet, hvor de fortyndes og nedbrydes enzymatisk17,44 (3) evnen til at isolere, kvantitere og karakterisere lipoproteinerne udskilt af tyndtarmen efter indtagelse af et lipidmåltid og fraværet af endotellipaser i mesenteriallymfen, som bevarer chylomicron triglyceridkoncentrationer og native chylomicron struktur46,47; (4) evnen til direkte at måle lymfestrømningshastighed, output af triglycerid og kolesterol (eller andre duodenal-infunderede forbindelser), chylomicronsammensætning og tarmhormonkoncentrationer. Endelig giver denne protokol mulighed for at indsamle relativt store mængder >50 μL lymfe hver time over en periode på 6 timer. Da væsken genopfyldes med intra-duodenal saltvand og glucoseinfusion, forbedres lymfefistelmodellen signifikant i forhold til andre lymfeprøvetagningsteknikker og resulterer i flydende snarere end statiske puljer af mesenterisk lymfe. Da volumen er en stor hindring for lipidomiske, proteomiske og metabolomiske tilgange, er dette en stor styrke.
1-dags muselymfefistelprotokollen beskrevet her har flere fordele i forhold til den oprindelige lymfefistelprotokol, herunder en reduktion i det samlede eksperimentelle dyreantal fra tidligere beskrevne 2-dages lymfefistleprotokoller26,27 på grund af en højere overlevelsesrate efter operationen; en reduktion af den samlede forsøgstid fra 2 dage til en enkelt dag og endelig en reduktion i restitutionsperioden for mus fra natten over (>18 timer), hvor gennembrudssmerter eller dårlige postkirurgiske resultater kan forekomme, til en mere håndterbar ~ 6 timers postoperativ periode.
Et træk ved denne 1-dags protokol er fokus på humane overvejelser og endepunkter. Disse skal have højeste prioritet: (1) dyr skal have intraduodenale eller IV erstatningsvæsker; (2) de skal holdes varme og så smertefri som muligt (med postoperativ Buprenex og/eller carprofen, afhængigt af forsøgsdesignet og behovet for at undgå antiinflammatoriske virkninger); (3) blødning, rysten, diarré eller tegn på nød er alle tvingende grunde til et humant endepunkt. I henhold til IACUC’s strenge retningslinjer er isofluran efterfulgt af cervikal dislokation et godt endepunkt. Kirurgiske overlevelsesrater er ~ 70% for en enkelt dag (sammenlignet med ~ 40% for den oprindelige 2-dages operation), men efterforskere bør ikke tøve med at afslutte eksperimentet ved et tegn på nød. Dette bør tages i betragtning ved planlægning af antallet af dyr.
Med hensyn til fejlfinding af denne teknik er vellykket placering af lymfekanylen den største flaskehals i denne kirurgiske procedure. Mens du praktiserer operationen, hjælper det med at gavge musen med 0,3 ml olivenolie ca. 2 timer før operationen. Dette vil medføre udskillelse af chylomicroner i mesenteriallymfekanalen, hvilket får den til at virke “mælkeagtig” og mere synlig. Methylenblåt kan også bruges, men er ofte mindre indlysende end den mælkeagtige lymfekanal. Hvis mesenteriallymfen efter placeringen af lymfekanylen og dens placering med lim med succes strømmer gennem kanylen ind i en opsamlingsbeholder, kan man fortsætte med placeringen af et duodenalt infusionsrør. Lejlighedsvis kan lymfen ikke flyde kontinuerligt, men kan begynde at flyde igen, når dyret placeres på rotationsbordet. Pas kritisk på blodpropper i lymfeslangen. Disse bør masseres ud af rørene for at forhindre tilbagestrømningstryk på lymfekanalen.
Ud over triglyceridsekretion og lymfestrømningshastighed kan denne teknik anvendes til at bestemme følgende lipidabsorptionskinetik og chylomicronegenskaber:
Chylomicron sekretion45,48,49
Umiddelbart efter et måltid, der indeholder fedt, er der en forbigående stigning i cirkulerende plasmatriglycerid. Da triglycerider i sagens natur er hydrofobe, skal de først emulgeres for at være opløselige i blod50. Tyndtarmens enterocytter udfører denne rolle og pakker triglycerid i kosten i chylomicron emulsionspartikler51. Chylomicrons indeholder kolesterol og kosten triglycerid i deres kerne, omgivet af fosfolipider og apolipoproteiner, herunder apoB-48, apoA-I, apoA-IV og apoC-III52,53,54,55. ApoB-48 er det essentielle strukturelle protein, og de andre apolipoproteiner har forskellige funktioner, der kræves for chylomicron metabolisme og clearance fra blodet. For at bestemme chylomicrons nøgleegenskaber, herunder deres triglycerid- og apolipoproteinindhold, bør 1-dags lymfefistlateknikken vist her anvendes. Chylomicron-sekretionshastigheden er procentdelen af infunderet 3H-triglycerid, der udskilles i lymfen og måles ved scintillation ved at tælle lymfeprøver hver time. Dette kan kombineres med detaljeret chylomicron karakterisering 48,49,56,57,58. Timelymfeprøver kan kombineres eller opbevares separat. Lymfe overføres til ultracentrifuge rør, blandes med 0,9% NaCl og overlejres derefter omhyggeligt med 300-500 μL 0,87% NaCl. Prøverne ultracentrifugeres derefter ved 110.000 x g ved 4 °C i 16 timer. De øverste fraktioner, der indeholder isolerede chylomikroner, indsamles og testes for triglyceridkoncentrationer ved hjælp af triglyceridanalysesættet. Kort fortalt inkuberes 2 μL chylomicron (1:10 fortynding) med 200 μL enzymreagens ved stuetemperatur i 10 minutter i en 96-brøndplade. Pladen læses af en pladelæser ved 500 nm, og standarderne og emnerne anvendes til beregning af triglyceridkoncentrationer. Chylomicron-størrelsen kan derefter bestemmes ved negativ farvning og transmissionselektronmikroskopi (TEM)14,29. Triglycerid og kolesterol kan kvantificeres ved kemisk analyse og apolipoproteinindhold (apoB-48, A-I, C-II, C-III) ved ELISA Kits eller Western blot.
Bestemmelse af det primære sted for lipidabsorption 48,59
Ved at isolere luminal- og epitelcellerummene i tolvfingertarmen, jejunum og ileum 6 timer efter infusion af 3H-triglycerid eller et radioaktivt mærket blandet måltid, ekstraheres indholdet folch for at bestemme, hvor meget af 3H-triglyceridet der absorberes over epitelcellemembranen (normalt) eller tilbageholdes i lumen (unormalt) langs tyndtarmens længde48 . Disse undersøgelser er særligt virkningsfulde, hvis der er potentielle forskelle i GI-motilitet 60,61,62, hvis der er en hypotese om galdesyrer (meget aktive gennem lipidabsorption og selv reabsorberet i ileum)63,64,65,66, eller hvis der er bekymring for, at næringsstoffer absorberes på det forkerte anatomiske sted (ileum eller endda tyktarm)67 ,68,69,70.
Identifikation af mekanismer for 3H-triglyceridhandel i absorberende epitelceller48
Dette udføres ved at beregne procentdelen af 3 H-triglycerid hydrolyseret til 3 H-fri fedtsyre i tarmens lumen, absorberet i slimhinden og re-esterificeret til intracellulært 3H-triglycerid før sekretion som chylomicrons. Dette er en kraftig markør for absorptions- / sekretionsdefekter, da det kan spores for at vise bevægelsen af triglycerid i kosten i dets nedbrydningsprodukter og efterfølgende emballering i chylomicroner. mRNA-ekspression af fedtsyreabsorptionsmaskineriet (CD36, FABP’er, ACSL’er), re-esterificeringsvej (MGAT, DGAT, MTTP, apoB) og apolipoproteiner (apoC-III, B-48, C-II, A-I, A-IV) kan yderligere kvantificeres ved RT-PCR.
Fremtidige anvendelser af denne teknik er kun begrænset af interesse for tarmorgan-krydstale, stofskifte, immunitet, næringsabsorption, miljømæssige kostforurenende stoffer eller enhver anden sygdom med en rolle i GI-systemet. Det er sandsynligt, at mange overbevisende eksperimenter og hypoteser er gået i stå på grund af vanskeligheden ved at få adgang til det kritiske mesenteriske lymfesystem, og målet med denne visualiserede protokol er at gøre denne teknik lettere tilgængelig. Isolering af chylomicroner og mesenteriallymfen, hvor de oprindeligt bor, er en kritisk del af forståelsen af helkropsmetabolisme; 1-dags muselymfefistelmodellen er en stærk fysiologisk model til at studere disse begivenheder.
The authors have nothing to disclose.
Vi er meget taknemmelige over for Cystic Fibrosis Foundation (Pilot and Feasibility Award 1810, til ABK), Rainin Foundation (Synergy Award, til PI GJ Randolph og Co-I ABK) og National Institutes of Health (R01DK118239, R03DK116011 til ABK) for deres støtte til disse undersøgelser.
0.9% Sodium Chloride Injection, USP sterile | Hospira, Lake Forest, IL, US | NDC 0409-4888-06 | |
1.7 mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 7200184 | |
14C-cholesterol: Cholesterol-[4-14C] (0.1mCi/ mL) | American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US | ARC 0857 | |
18 G needle | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US | 305199 | |
2 Dumont micro-dissecting forceps | Fine Science Tools, Foster City, CA, US | 11251-35 | |
2 Forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5130 | |
3H-TAG: Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1mCi/ mL) | American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US | ART0199 | |
3H-TG Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) | American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis | MO 63146 | |
50% Dextrode Injection, USP 25grams/50 mL sterile | Hospira, Lake Forest, IL, US | NDC-0409-6648-16 | |
Analtech TLC Uniplates: silica gel matrix Z265500-1PAK | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 11-101-0007 | |
BD CareFusion ChloraPrep Swabstick | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 14-910-501 | |
Betadine surgical scrub | Dynarex Corp., Orangeburg, NY, US | 1201 | |
Bevel-cut cannula | Braintree Scientific., Braintree , MA, US | MRE025 | |
Buprenorphine HCl Injection Carpuject PFS 0.3mg/mL 10/Bx (Buprenex) | HenrySchein, Warrendale, PA, US | 1278184 | |
C57BL6/J male mice | Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine | ||
ChloraPrep | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US | 260100 | |
Cholesterol Assay Kit | FujiFilm Healthcare, Lexington, MA, US | 99902601 | |
Cholesterol-[4-14C] | American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis | MO 63146 | |
Clear plexiglass box L43cm X W26 X H 21 with temperature-controlled heating pad and humidification | our own design and modifications | ||
commercially available amphibian/reptile heating pad | ShenZhen XingHongChang Electric CO., LTD. ShenZhen, China | XHC-F035D | |
Cotton tip applicators | Fisher Scientific, Waltham, MA, US | 22363156 | |
Duodenal infusion tube – canuala | Braintree Scientific, Braintree , MA, US | MRE037 | |
Ensure | Abbott Nutrition, Columbus, OH | ||
Heating pad surgical platform with circulating warm water pump combination | Patterson Scientific, Waukesha, WI, US | Gaymar T/Pump Classic | |
Hetarin Sodium Injection, USP 1,000 units/mL sterile | Mylan, Morgantown, WV, US | NDC-67457-384-31 | |
Image J Software | National Institute of Health, Bethesda, Maryland, | ||
Iris scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5602 | |
Isoflurane | Piramal Pharma Solutions, Riverview, MI, US | NDC 66794-017-25 | |
Isoflurane induction apparatus and Anesthesia Apparatus | Patterson Scientific, Waukesha, WI, US | mouse induction chamber | |
Krazy glue | Elmer's products Inc., Columbus, OH, US | KG484 | |
Liposyn III 20% lipid injectable | Hospira Inc. Lake Forest, Illinois, USA | ||
LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
Micro-dissecting Spring Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5602 | |
Mouse apoB ELISA Kit | ABCAM Inc., Waltham, MA, US | ab230932-1 | |
Needle Holder | Fine Science Tools, Foster City, CA, US | 12002-12 | |
Retractors | Kent Scientific Co., Torrington, CT, US | SURGI-5001 | |
Rimadyl (Carprofen) | Zoetis Inc., Kalamazoo MI, US | 4019449 | |
Rotating table Barnstead Thermolyne | Labquake, Zürich, Switzerland | Barnstead Thermolyne | |
SMOFlipid 20% lipid injectable emulsion, USP | Fresenius Kabi, Warrendale, PA, US | NDC-63323-820-01 | |
Snuggle | Lomir Biomedical Inc., Notre-Dame-de-l'Île-Perrot, QC J7V 7M4, Canada | MS 02.5PM | |
Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US | RS-5912SC | |
Suture (5-0 silk with needle) | DemeTECH, Miami Lakes, FL, US | DT-719 | |
Transmission Electron Microscope (JEOL 1400-FLASH 120KV ) | JEOL, Peabody, MA | ||
Triglyceride Assay Kit | Randox Laboratories, Crumlin, United Kingdom | TR210 | |
ULTIMA GOLD XR Scintillation Fluid | Perkin Elmer, Hebron, KY, US | 6013119 | |
Ultracentrifuge, rotor S100AT4-497 | SORVALL RC M120 GX |