Descifrando el mecanismo molecular y la función de las toxinas formadoras de poros usando Leishmania major
Summary
Aquí se presenta un protocolo que utiliza promastigotes mayores de Leishmania para determinar la unión, citotoxicidad y señalización inducida por toxinas formadoras de poros. Se proporciona una prueba de concepto con estreptolisina O. Otras toxinas también se pueden utilizar para aprovechar los mutantes genéticos disponibles en L. major para definir nuevos mecanismos de resistencia a las toxinas.
Abstract
Comprender la función y el mecanismo de las toxinas formadoras de poros (PFT) es un desafío porque las células resisten el daño de la membrana causado por las PFT. Si bien los enfoques biofísicos ayudan a comprender la formación de poros, a menudo se basan en enfoques reduccionistas que carecen del complemento completo de lípidos y proteínas de membrana. Las células humanas cultivadas proporcionan un sistema alternativo, pero su complejidad y redundancias en los mecanismos de reparación dificultan la identificación de mecanismos específicos. En contraste, el patógeno protozoario humano responsable de la leishmaniasis cutánea, Leishmania major, ofrece un equilibrio óptimo entre complejidad y relevancia fisiológica. L. major es genéticamente tratable y puede ser cultivado a alta densidad in vitro, y cualquier impacto de las perturbaciones en la infección puede medirse en modelos murinos establecidos. Además, L. major sintetiza lípidos distintos de sus homólogos mamíferos, lo que podría alterar la dinámica de la membrana. Estas alteraciones en la dinámica de la membrana se pueden probar con PFT de la familia de toxinas mejor caracterizada, las citolisinas dependientes del colesterol (CDC). Los CDC se unen al ergosterol en la membrana de Leishmania y pueden matar los promastigotes de L. major, lo que indica que L. major es un sistema modelo adecuado para determinar los mecanismos celulares y moleculares de la función de PFT . Este trabajo describe métodos para probar la función de PFT en promastigotes de L. major , incluido el cultivo de parásitos, herramientas genéticas para evaluar la susceptibilidad a los lípidos, ensayos de unión a la membrana y ensayos de muerte celular. Estos ensayos permitirán el uso rápido de L. major como un poderoso sistema modelo para comprender la función de PFT en una gama de organismos evolutivamente diversos y puntos en común en la organización de lípidos.
Introduction
Las toxinas formadoras de poros (PFT) son la familia más grande de toxinas bacterianas1, pero los mecanismos por los cuales perforan y destruyen las células son poco conocidos. La familia mejor estudiada de toxinas formadoras de poros es la de las citolisinas dependientes del colesterol (CDC). Los CDC son sintetizados principalmente por bacterias grampositivas, incluido el agente causal de la fascitis necrotizante, Streptococcus pyogenes2. S. pyogenes secreta la estreptolisina O (SLO) de los CDC, que se une a los esteroles en la membrana plasmática de las células huésped como monómeros, oligomeriza e inserta poros ~20-30 nm en la membrana1. El papel que juegan los lípidos en este proceso sigue estando poco determinado.
Un enfoque para estudiar las interacciones lípido-CDC es el uso de liposomas químicamente definidos. Si bien los liposomas definidos proporcionan información sobre los umbrales necesarios de lípidos para mantener la unión a toxinas y la formación de poros3,4, no recapitulan completamente las funciones celulares. Por ejemplo, los liposomas reconstituidos carecen de la asimetría lipídica de los huéspedes mamíferos y de las modificaciones lipídicas en respuesta a las toxinas5. Una alternativa a los liposomas es utilizar líneas celulares de mamíferos. Si bien estas líneas celulares son más relevantes fisiológicamente, existe un alto grado de redundancia en los mecanismos de detección y resistencia a toxinas2. Como consecuencia, las vías de reparación utilizadas para resistir los CDC siguen estando mal determinadas. En particular, la afluencia de Ca2+ es el principal activador de la reparación de la membrana1. Aguas abajo de la afluencia de Ca2+, se activan múltiples vías, incluida una reparación dependiente de ceramida 6,7 y una vía de reparación dependiente de MEK6. Estas vías interactúan con otros efectores proteicos, incluyendo el complejo de clasificación endosomal requerido para el transporte (ESCRT)8, y las anexinas 6,9,10. La disección de estas vías en células de mamíferos es un desafío debido a la redundancia, que confunde la interpretación de los datos.
Una forma de equilibrar la complejidad con la simplicidad para diseccionar las vías de reparación es el uso de organismos más simples, como los patógenos protozoarios del género Leishmania. Leishmania sp. causa leishmaniasis en humanos y otros animales. La leishmaniasis varía desde la leishmaniasis cutánea (lesiones cutáneas autolimitadas) hasta la leishmaniasis visceral fatal (hepatoesplenomegalia), dependiendo de la especie y otros factores11. La Leishmania mayor, el agente causal de la leishmaniasis cutánea, se transmite a los humanos a través de un vector de flebótomo y se utiliza para comprender la función y la infección de Leishmania 12. Además, Leishmania sp. son digénicos12. Existen como parásitos macrófagos mamíferos intracelulares denominados amastigotes y como promastigotes flagelados que nadan libremente en el flebótomo12. Los promastigotes de L. major pueden cultivarse en medios suplementados con suero como M199 a alta densidad13. Los promastigotes también son genéticamente tratables; Existen muchos knockouts genéticos, incluidos los dirigidos a las vías de biosíntesis de lípidos13. Estos knockouts pueden ser evaluados para el crecimiento y las diferencias en la infectividad y el desarrollo de lesiones a través de la infección de ratones Balb/c13.
Además de la relativa facilidad del cultivo de Leishmania y la gama de knockouts de biosíntesis de lípidos, el parásito tiene un genoma más simple que los mamíferos. La especie mejor caracterizada de Leishmania es L. major, que tiene muchas herramientas genéticas existentes, como mutantes con metabolismo lipídico defectuoso14. En particular, muchas proteínas de reparación están ausentes. L. major no tiene homólogos identificados hasta la fecha para proteínas clave de reparación de mamíferos como las anexinas. Esto permite la caracterización de vías de reparación conservadas evolutivamente sin la complejidad de los sistemas de mamíferos. Sin embargo, las vías de reparación no se han caracterizado en Leishmania hasta la fecha. Al mismo tiempo, las vías de señalización clave involucradas en la reparación, como la vía MEK6, se conservan en Leishmania sp.15,16, aunque los homólogos deben ser validados. La vía de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) está bien estudiada en L. mexicana, donde contribuye a la supervivencia intracelular y la termoestabilidad en células de mamíferos y controla la metaciclogénesis16. En Leishmania sp., 10 de los 15 MAPK han sido caracterizados17. Se predice que LmMAPK9 y LmMAPK13 serán los más similares a ERK1/2 de mamíferos según la identidad en la secuencia labial de fosforilación conservada. La secuencia de fosforilación del labio es TEY tanto para ERK1/2 de mamíferos como para LmMAPK9 y LmMAPK13. Sin embargo, ocho de los MAPK de Leishmania tienen un motivo de fosforilación TDY15. Se han identificado al menos dos homólogos de MEK en Leishmania sp., LmxMKK18 y quinasa relacionada con MEKK (MRK1)19. Esto sugiere que las ideas identificadas en Leishmania podrían traducirse a sistemas de mamíferos. Cuando no se traducen en sistemas de mamíferos, representan dianas terapéuticas para tratar la leishmaniasis.
Para utilizar L. major promastigotes para estudiar la reparación de la membrana y las interacciones con toxinas, se necesitan técnicas de rendimiento medio. Si bien las imágenes de células vivas de alta resolución permiten la visualización de proteínas y membranas marcadas en tiempo real, es de bajo rendimiento y es posible que no mida la supervivencia celular. Los ensayos de viabilidad de rendimiento medio incluyen la absorción de colorantes medida por citometría de flujo, la medición de la actividad mitocondrial o la liberación de proteínas celulares como la lactato deshidrogenasa (LDH). En células de mamíferos, los ensayos de LDH no miden cuantitativamente la muerte celular20. Además, los ensayos basados en la población, como la liberación de LDH o la actividad mitocondrial, no permiten un análisis robusto de una sola célula o multiparamétrico20. Por el contrario, los ensayos basados en citometría de flujo permiten el análisis multiparamétrico unicelular20. Sin embargo, estos ensayos no se han aplicado para comprender la biología de las toxinas o las respuestas a las toxinas en los promastigotes de L. major.
En este estudio, SLO se utiliza como una herramienta para comprender la perturbación de la membrana plasmática del mutante nulo esfingolípido de L. major en dos tampones diferentes: el medio M199 utilizado rutinariamente para cultivar promastigotes de L. major y el tampón de Tyrode, más simple . Se describe un ensayo de citometría de flujo de rendimiento medio que se utiliza para generar curvas dosis-respuesta de toxinas. Los datos del ensayo citométrico de flujo se modelan en una curva logística para determinar los valores de CL50 . Con esta información, se puede determinar una dosis sublítica de SLO para que los anticuerpos MAPK puedan validarse mediante Western blotting.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, se describieron métodos para estudiar los mecanismos moleculares y las funciones de las PFT, utilizando el patógeno humano Leishmania major como sistema modelo. Se desarrolló un ensayo de citotoxicidad basado en citometría de flujo de rendimiento medio para medir la viabilidad de una sola célula. La viabilidad es cuantitativa a nivel poblacional porque los valores de CL50 se pueden calcular a partir de la curva dosis-respuesta utilizando modelos logísticos. Como prueba de princi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a los miembros de los laboratorios Keyel y Zhang por su revisión crítica del manuscrito. Los autores agradecen a la Facultad de Artes y Ciencias Microscopía por el uso de las instalaciones.
Materials
| 1.2 mL microtiter (Marsh) tubes | Fisher | 02-681-376 | Cytotoxicity assay |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | Toxin dilutions |
| 15 mL centrifuge tube | Avantor VWR (Radnor, PA) | 89039-666 | To hold cells and media |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399 | For cell processing |
| 3% H2O2 | Walmart (Fayetteville, AR) | N/A | For ECL |
| 5x M199 | Cell-gro | 11150067 | Basal growth media for L. major promastigotes |
| Biosafety cabinet | Baker | To culture cells in sterile conditions | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher | BP1605-100 | Fraction V acceptable purity |
| CaCl2 | Fisher | BP510-100 | Stock concentration 100 mM |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Megafuge 40R | To pellet the cells from culture |
| Cy5 Mono-reactive dye pack | Cytiva (Marlborough, MA) | PA25031 | Fluorophore label for toxins |
| Digital dry bath | Benchmark | BSH1002 | To denature protein samples |
| EGTA | Amresco | 0732-100G | Stock concentration 0.5 M |
| Excel | Microsoft (Redmond, VA) | Data analysis software | |
| Flow cytometer (4-laser Attune NxT) | Fisher | Cytometer for data acquisition | |
| FlowJo | BD (Ashland, OR) | Software | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | Fixative for counting cells |
| G418 | Fisher | BP673-1 | Selection agent for cells |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | Dilute 1:4 for cleaning cytometer |
| Hemacytometer | Fisher | 0267151B | For counting cells |
| Human red blood cells | Zen-bio (Durham, NC) | SER-10MLRBC | To validate toxin activity |
| Ice bucket | |||
| Light microscope | Nikon | Eclipse 55i | To visualize cells |
| Nitrocellulose | Fisher | 88018 | For probing proteins via antibodies |
| Pipettors and tips | Avantor VWR | To dispense reagents | |
| Power supply | Bio-Rad | To run SDS-PAGE and transfers | |
| Propidium iodide | Biotium | 40016 | Stock concentration 2 mg/mL in water |
| Protein ladder | Bio-Rad | 161-0373 | To determine molecular weight of proteins |
| SDS-PAGE Running Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 165-3302 | To separate proteins based on their size |
| Sealing tape | R&D | DY992 | To seal plates with cells |
| Streptolysin O C530A plasmid insert | Cloned into pBAD-gIII vector (Reference: 7) | ||
| Streptolysin O C530A toxin | Lab purified | Specific activity 4.34 x 105 HU/mg | |
| Swinging bucket rotor | Thermo Fisher | 75003607 | To centrifuge cells |
| V-bottom plate | Greiner Bio-one | 651206 | For cytotoxicity assay |
| Vortex | Benchmark | BV1000 | To mix cells |
| Western blot imaging system (Chemi-doc) | Bio-Rad | To visualize proteins by western blot | |
| Western Blot Transfer Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 170-3930 | Transfer proteins to nitrocellulose |
| Whatman Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-700 | Used in transfer of proteins to nitrocellulose |
| Antibody | |||
| Anti-ERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9102S | Rabbit (1:1000 dilution) |
| Anti-lipophosphoglycan (LPG) antibody | CreativeBioLabs | Cat# WIC79.3 | Mouse (1: 1000) |
| Anti-MEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9122L | Rabbit (1:1000) |
| Anti-mouse IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#715-035-151 | Donkey (1:10000) |
| Anti-phosphoERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9101S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-pMEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9121S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-rabbit IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#711-035-152 | Donkey (1:10000) |
| Anti-tubulin antibody | Sigma | Cat# T5168 | Mouse (1: 2000) |
| Leishmania major Genotypes | Reference: 13 | ||
| Episomal addback (spt2–/+SPT2) | Δspt2::HYG/Δspt2:PAC/+pXG-SPT2 | ||
| Serine palmitoyltransferase subunit 2 knockout (spt2–) | Δspt2::HYG/Δspt2::PAC | ||
| Wild type (WT) | LV39 clone 5 (Rho/SU/59/P) |
References
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