Le présent protocole démontre l’utilisation d’un test d’amplification exponentielle rapide en 3 étapes, basé sur des aptamères, pour détecter des cibles. La préparation des échantillons, l’amplification du signal et le développement de la couleur sont couverts pour mettre en œuvre ce système afin de reconnaître la présence de théophylline par rapport à celle de la caféine.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Détection de cible basée sur des aptamères facilitée par une réaction d’amplification exponentielle isotherme G-quadruplex en 3 étapes
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les aptamères sont des molécules de reconnaissance de cibles qui se lient avec une affinité et une spécificité élevées. Ces caractéristiques peuvent être exploitées pour contrôler d’autres molécules ayant une capacité de génération de signal. Pour le système décrit ici, la reconnaissance de cible par un domaine aptamérique, Stem II d’un ribozyme à tête de marteau modifié, active le ribozyme auto-clivant en stabilisant la construction initialement non structurée. L’ARN clivant le cis agit à la jonction de la tige III et de la tige I, créant deux produits de clivage. Le produit de clivage plus long amorce une réaction d’amplification exponentielle isotherme (EXPAR) des deux G-quadruplexes catalytiquement actifs similaires. Ces produits d’amplification qui en résultent catalysent la réduction de la peroxydase, qui est couplée à la réduction d’un substrat colorimétrique avec une sortie que l’œil nu peut détecter. Le système en 3 parties décrit dans la présente étude améliore les modalités de détection telles que les tests immuno-enzymatiques (ELISA) en produisant un signal visuellement détectable pour indiquer la présence de théophylline aussi faible que 0,5 μM en aussi peu que 15 minutes.
Introduction
Les aptamères sont généralement de l’ADN ou de l’ARN simple brin sélectionnés par un processus évolutif avec une affinité et une spécificité de liaison élevées pour les cibles souhaitées1. En plus de la capacité de liaison, les aptamères peuvent être reliés et contrôler des motifs avec des fonctions signal-sortie2,3, amplifiant ledit signal et améliorant la sensibilité du système. Le système de réaction d’amplification exponentielle isotherme G-quadruplex (GQ-EXPAR) est un système en trois parties (Figure 1) qui développe un signal vis....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Voir le tableau supplémentaire 1 (tableau de configuration de la réaction) pour la préparation des tubes, y compris les volumes et concentrations spécifiques des composants de la réaction. Le protocole illustré ici utilise un kit de plate-forme de détection préassemblé tel que décrit dans le tableau des matériaux. Tous les composants doivent être conservés sur la glace, sauf indication contraire.
1. Préparation du ribozyme
REMARQUE : La principale composante de détection est un ribozyme allostérique (régulé par aptamère) reconnaissant la théophylline (voir ....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
La plate-forme de détection représentée à la figure 1 convertit la reconnaissance de cibles aptamériques en différences visuellement distinctes entre les préparations d’échantillons (cibles et non cibles, figure 2) dans un court laps de temps. Un ribozyme allostérique identifié par Soukup et al.5 a servi de point de départ pour créer une séquence moins bruyante avec une réponse à la cible sur les échantillons témoins et négatifs. La const.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
La méthode présentée ici tire parti de la transition entre une structure secondaire initialement désordonnée dans un ribozyme allostérique et la stabilité supplémentaire conférée par la liaison de la cible au domaine aptamique pour activer le ribozyme à tête marteau clivant cis. La stabilité du ribozyme a été ajustée pour minimiser l’activité catalytique en l’absence de la cible tout en permettant à la liaison de la cible de restaurer la structure active. De plus, il faut veiller à équilibrer les tampons des multiples en.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Aptagen, LLC fabrique et commercialise un kit de démonstration GQ-EXPAR pour ceux qui veulent une expérience directe avec un système de détection basé sur aptamère.
Remerciements
Cette recherche a été soutenue par le financement de la recherche et du développement d’Aptagen LLC.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Solution de dichlorhydrate de tétraméthylbenzidine (TMB) de 3,3',5,5'-avec H2O2, « MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution" | PerkinElmer | FOOD-1806-1000 | Réactif de développement de couleur. Minimisez l’exposition à la lumière et à l’atmosphère. Précédemment BIOO Scientific, numéro de catalogue 1806. Livré dans le kit de démonstration de balise Apta sous forme de tube 3-2. |
| 5'- TCC CTC CCT CCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC CTC CCA GA-Biotine-3' | Integrated DNA Technologies (IDT) | Modèle d’ADN QtQ47 optimisé personnalisé pour EXPAR afin de produire G-quadruplex, amorcé par G-quadruplex. Ceci est utilisé pour la partie « exponentielle » d’EXPAR, afin d’augmenter rapidement la quantité de DNAzyme utilisée pour le développement des couleurs de l’étape 3. Le modèle comprend une biotine 3' pour empêcher l’extension involontaire par l’ADN polymérase Bst 2.0 pendant EXPAR. Partie du kit de démonstration Apta-beacon Tube 2-2. | |
| 5'-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU | Integrated DNA Technologies (IDT) | Séquence de | ribozyme allostérique personnalisée reconnaissant la théophylline (ribozyme auto-clivant régulé par le domaine de l’aptamère d’ARN pour la théophylline) modifiée d’après Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., et Breaker, R. R. (2000) Modification de la reconnaissance moléculaire des aptamères d’ARN par sélection allostérique, Journal of molecular biology 298, 623-632. Fourni dans le kit de démonstration Apta-beacon sous forme de tube 1-3. |
| 5'-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotine-3' | Technologies d’ADN intégrées (IDT) | Modèle d’ADN P3tQ49 optimisé personnalisé pour EXPAR afin de produire G-quadruplex, amorcé par le produit de clivage P3. Ceci est utilisé à l’étape 2 pour traduire le produit de clivage en DNAzyme utilisé pour le développement de la couleur à l’étape 3. Le modèle comprend une biotine 3' pour empêcher l’extension involontaire par l’ADN polymérase Bst 2.0 pendant EXPAR. Partie du kit de démonstration Apta-beacon Tube 2-2. | |
| 5x Tampon Ribozyme | Aptagen, LLC | N/A | 5x composition : 600 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Utilisé à l’étape 1. Fourni dans le kit de démonstration de balise Apta en tant que tube 1-4. |
| Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Kit de démonstration | Aptagen, LLC | GQ-EXPAR-TMB | Le kit de démonstration met en évidence la spécificité du test colorimétrique en détectant des cibles de petites molécules difficiles, la théophylline par rapport à la caféine, qui ne diffèrent que par un seul groupe méthyle. |
| ADN polymérase Bst 2.0 | New England Biolabs | M0537S | Polymérase d’amplification isotherme avec activité de déplacement de brin. Fait partie du mélange Nickase-Polymérase, préparé à 9.375 U/uL. Fait partie du kit de démonstration Apta-beacon Tube 2-1. |
| Tampon 3.1 | New England Biolabs | B6003SVIAL | Combiné avec 2 μL de tampon d’amplification isotherme 10X et 27,5 μL d’eau sans nucléase pour produire un tampon EXPAR 1,11X dans EXPAR Mix. Ce produit remplace le B7203SVIAL précédemment utilisé qui faisait partie du développement initial du système (même composition sauf BSA non recombinant). Fait partie du kit de démonstration Apta-beacon Tube 2-2. |
| Caféine | Sigma-Aldrich | C0750-100G | Contre-cible aptamère (témoin), préparée avec de l’eau sans nucléases. Livré dans le kit de démonstration Apta-beacon sous forme de tube 1-1. |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447S | Fait partie du mélange réactionnel EXPAR. Fait partie du kit de démonstration Apta-beacon Tube 2-2. |
| Mélange réactionnel EXPAR | Aptagen, LLC | N/A | 0,44 mM dNTPs, 0,38 &mu ; M P3tQ49, 0,38 &mu ; M QtQ47, 44,44 mM Tris-HCl (pH 8,4), 63,5 mM NaCl, 31,5 mM KCl, 6,35 mM MgCl2, 1,27 mM MgSO4, 6,35 mM (NH4)2SO4, 63,5 &mu ; g/ml BSA, 0,0635 % Tween 20, Partie du kit de démonstration Apta-beacon Tube 2-2. |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | remis en suspension dans du DMF à une concentration finale de 25 uM. Fourni dans le kit de démonstration de balise Apta sous forme de tube 3-1. |
| Tampon d’amplification isotherme | New England Biolabs | B0537SVIAL | combiné avec 2 μL de 10x Buffer 3.1 et 27.5 µ ; L d’eau sans nucléases pour produire un tampon EXPAR 1,11x dans EXPAR Mix. Partie du kit de démonstration Apta-beacon Tube 2-2. |
| MgCl2 | Amresco (VWR) | E525-500ML | Cofacteur ribozyme Hammerhead, nécessaire pour l’auto-clivage. Partie du kit de démonstration Apta-beacon Tube 1-3. |
| Thermocycleur MJ PTC-100 | MJ Research, Inc. | Thermocycleur PTC-100 | pour contrôler les températures d’incubation. N’importe quel thermocycleur ou bloc chaud peut être utilisé. |
| N, N-diméthylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056-100ML | Utilisé pour remettre l’hémine en suspension et maximiser la durée de conservation dans le congélateur. Fait partie du kit de démonstration Apta-beacon Tube 3-1. |
| Mélange nickase-polymérase | Aptagen, LLC | N/A | Nt.BstNBI (9.375 unités/&mu ; L) et l’ADN polymérase Bst 2.0 (0,5 unités/&mu ; L). Livré dans le kit de démonstration de balise Apta en tant que tube 2-1. |
| Nt.BstNBI | New England Biolabs | R0607S | Enzyme d’entaille pour permettre une amplification isotherme continue. Fait partie du mélange nickase-polymérase, préparé à 0,5 U/uL. Fait partie du tube 2-1 du kit de démonstration Apta-beacon. |
| Tampon kinase T4 | New England Biolabs | B0201SVIAL | Tampon pour enzyme nécessaire à l’élimination du phosphate cyclique. Partie du kit de démonstration Apta-beacon Tube 1-4. |
| Polynucléotide kinase T4 | New England Biolabs | M0201S | Élimine le phosphate cyclique post-clivage pour permettre au produit de clivage d’amorcer la réaction d’amplification isotherme. Fourni dans le kit de démonstration Apta-beacon sous forme de tubes PCR. |
| Tecan GENios FL | Tecan | Genios-FL TWT | Lecteur de plaques pour mesurer le signal d’absorbance à partir des résultats de l’étape 3. |
| Cible d’aptamère Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633-50G | , préparée avec de l’eau sans nucléases. Fourni dans le kit de démonstration de balise Apta sous forme de tube 1-2. |
| Tris-HCl | American Bioanalytical | AB14043-01000 | Tampon de liaison Aptamer. Partie du kit de démonstration Apta-beacon Tube 1-4. |
Références
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tang, J., Breaker, R. R. Rational design of allosteric ribozymes. Chemical Biology. 4 (6), 453-459 (1997).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehli....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
