Detecção de alvos baseada em aptâmero facilitada por uma reação de amplificação exponencial isotérmica G-quadruplex de 3 estágios
Summary
O presente protocolo demonstra o uso de um ensaio rápido de amplificação exponencial baseado em aptâmeros de 3 estágios para detectar alvos. A preparação da amostra, a amplificação do sinal e o desenvolvimento da cor são abordados para implementar este sistema para reconhecer a presença de teofilina sobre a cafeína.
Abstract
Os aptâmeros são moléculas de reconhecimento de alvos que se ligam com alta afinidade e especificidade. Essas características podem ser aproveitadas para controlar outras moléculas com capacidade de geração de sinal. Para o sistema aqui descrito, o reconhecimento do alvo através de um domínio aptamérico, o Tronco II de uma ribozima de cabeça de martelo modificada, ativa a ribozima autoclivagante, estabilizando o construto inicialmente não estruturado. O RNA de clivagem cis atua na junção do Tronco III e do Tronco I, criando dois produtos de clivagem. O produto de clivagem mais longa prepara uma reação de amplificação exponencial isotérmica (EXPAR) dos dois G-quadruplexes cataliticamente ativos semelhantes. Esses produtos de amplificação resultantes catalisam a redução da peroxidase, que é acoplada à redução de um substrato colorimétrico com uma saída que o olho nu pode detectar. O sistema de 3 partes descrito no presente estudo melhora as modalidades de detecção, como ensaios imunoenzimáticos (ELISAs), produzindo um sinal visualmente detectável para indicar a presença de tão baixa quanto 0,5 μM de teofilina em apenas 15 minutos.
Introduction
Os aptâmeros são tipicamente DNA ou RNA de fita simples selecionados através de um processo evolutivo com alta afinidade e especificidade de ligação aos alvosdesejados 1. Além da capacidade de ligação, os aptâmeros podem ser ligados e controlar motivos com funções de saída de sinal2,3, amplificando o referido sinal e melhorando a sensibilidade do sistema. O sistema G-quadruplex isothermal exponencial amplification reaction (GQ-EXPAR) é um sistema de três partes (Figura 1) que desenvolve um sinal visual à medida que componentes sucessivos são adicionados a um único vaso de reação para produzir uma saída visual4. Este sistema permite a detecção de um alvo específico, aqui teofilina, em uma determinada amostra dentro de 15 min usando um fluxo de trabalho simplificado para permitir a detecção rápida e específica de um alvo de interesse. Este método deve ser considerado para amostras em que a quantificação específica da concentração-alvo é uma preocupação menor do que a elevada especificidade da resposta num curto período de tempo.
Um riboswitch alostérico, uma molécula de RNA de mudança de estrutura (ribozima) que sofre autoclivagem, produz o sinal inicial. Este construto é baseado na ribozima martelo, com um domínio aptamérico introduzido no Tronco II como regulador da atividade de clivagem. Sua função de autoclivagem é ativada quando seu domínio aptamérico é estabilizado ao se ligar ao seualvo5. Caso contrário, o switch ficará inativo em seu estado nativo.
A reação de amplificação exponencial subsequente (EXPAR) utiliza a liberação da fita de RNA autoclivada do primeiro estágio para desencadear uma reação de amplificação isotérmica6. O produto amplificador do EXPAR possui atividade peroxidase7, atuando como base para o último estágio do sistema. Quando alguns substratos são oxidados em conjunto com a quebra de peróxido, eles produzem uma saída fluorescente que pode ser medida em vários instrumentos. Outros substratos comuns podem ser substituídos para produzir um produto colorido para detecção visual. O EXPAR e a atividade peroxidase de seus produtos de amplificação atuam como um intensificador de sinal em 2 estágios, aumentando a sensibilidade a níveis maiores em comparação com as estratégias convencionais 7,8.
A detecção de teofilina versus cafeína é utilizada como exemplo da especificidade dessa plataforma de detecção, pois diferem por apenas um grupo metila (Figura 2). Esta demonstração do sistema produz uma saída colorimétrica para detecção visual de pelo menos 500 nM teofilina.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método aqui apresentado aproveita a transição entre uma estrutura secundária inicialmente desordenada em uma ribozima alostérica e a estabilidade adicional conferida pela ligação do alvo ao domínio aptamérico para ativar a ribozima cis-cleave. A estabilidade da ribozima foi ajustada para minimizar a atividade catalítica na ausência do alvo, permitindo a ligação do alvo para restaurar a estrutura ativa. Além disso, deve-se tomar cuidado para equilibrar os tampões das múltiplas enzimas necessárias para f…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo Research and Development Funding da Aptagen LLC.
Materials
| 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution" | PerkinElmer | FOOD-1806-1000 | Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2. |
| 5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3. |
| 5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5x Ribozyme Buffer | Aptagen, LLC | N/A | 5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4. |
| Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit | Aptagen, LLC | GQ-EXPAR-TMB | The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group. |
| Bst 2.0 DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| Buffer 3.1 | New England Biolabs | B6003SVIAL | Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-100G | Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1. |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447S | Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| EXPAR reaction mixture | Aptagen, LLC | N/A | 0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1. |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537SVIAL | Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| MgCl2 | Amresco (VWR) | E525-500ML | Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3. |
| MJ PTC-100 Thermocycler | MJ Research, Inc. | PTC-100 | Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used. |
| N, N-Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056-100ML | Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1. |
| Nickase-polymerase Mix | Aptagen, LLC | N/A | Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1. |
| Nt.BstNBI | New England Biolabs | R0607S | Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| T4 Kinase Buffer | New England Biolabs | B0201SVIAL | Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes. |
| Tecan GENios FL | Tecan | Genios-FL TWT | Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results. |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633-50G | Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2. |
| Tris-HCl | American Bioanalytical | AB14043-01000 | Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
References
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