Optimering af flowcytometriske sorteringsparametre til high-throughput isolering og oprensning af små ekstracellulære vesikler

Summary

Denne protokol giver en hurtig og størrelsesspecifik isoleringsmetode til små ekstracellulære vesikler ved at optimere størrelsen på luftsprøjtedysen, kappevæsketrykket, prøveflowtrykket, spændingen, forstærkningen og udløsningstærskelparametrene.

Abstract

Små ekstracellulære vesikler (sEV) kan frigives fra alle celletyper og bære protein, DNA og RNA. Signalmolekyler tjener som indikatorer for en celles fysiologiske og patologiske tilstand. Der findes imidlertid ingen standardmetode til sEV-isolering, som forhindrer downstream-biomarkøridentifikation og lægemiddelinterventionsundersøgelser. I denne artikel giver vi en detaljeret protokol til isolering og oprensning af 50-200 nm sEV ved hjælp af en flowcellesorterer. Til dette blev der valgt en 50 μm dyse og 80 psi kappevæsketryk for at opnå en god sorteringshastighed og stabil sidestrøm. Standardstørrelse polystyrenmikrosfærer blev brugt til at lokalisere populationer af 100, 200 og 300 nm partikler. Med yderligere optimering af udløsertærsklen for spænding, forstærkning og fremadspredning (FSC) kunne sEV-signalet adskilles fra baggrundsstøjen. Disse optimeringer giver et panel af kritiske sorteringsindstillinger, der gør det muligt at opnå en repræsentativ population af sEV udelukkende ved hjælp af FSC vs. side scatter (SSC). Den flowcytometribaserede isolationsmetode giver ikke kun mulighed for analyse med høj kapacitet, men giver også mulighed for synkron klassificering eller proteomanalyse af sEV baseret på biomarkørekspressionen, hvilket åbner adskillige downstream-forskningsapplikationer.

Introduction

En celle frigiver ekstracellulære vesikler (EV’er) af forskellig størrelse, der resulterer i signalmolekyler og membranindeslutninger, som er vigtige for intercellulær kommunikation¹. EV’er i forskellige størrelser spiller også forskellige biologiske roller, hvor 50-200 nm sEV er i stand til præcist at distribuere RNA, DNA og proteiner til den korrekte ekstracellulære placering. SEV hjælper også med at bestemme deres sekretionsmekanismer, der ikke kun involverer regulering af normale fysiologiske processer såsom immunovervågning, stamcellevedligeholdelse, blodkoagulation og vævsreparation, men også patologien bag flere sygdomme såsom tumorprogression og metastase ^2,3. Effektiv isolering og analyse af sEV er afgørende for at identificere biomarkører og designe fremtidige lægemiddelinterventioner.

Med kontinuerlig forskning i den kliniske anvendelse af sEV har isolationsmetoderne for sEV fremsat højere krav. På grund af heterogeniteten af sEV i størrelse, kilde og indhold samt deres lighed med andre EV’er i fysisk-kemiske og biokemiske egenskaber er der ingen standardmetode til sEV-isolering ^4,5. I øjeblikket er ultracentrifugering, størrelsesekskluderingskromatografi (SEC), polymerudfældning og immunoaffinitetsindfangning de mest almindelige sEV-isolationsmetoder⁶. Ultracentrifugering er stadig guldstandarden for sEV-isolering i forskning, på trods af at det er tidskrævende, hvilket resulterer i lav renhed med en bred størrelsesfordeling på 40-500 nm og betydelig mekanisk skade på sEV efter langvarig centrifugering ^7,8,9. Polymerudfældning, som normalt bruger polyethylenglycol (PEG), lider af uacceptabel renhed til efterfølgende funktionel analyse med samtidig udfældning af ekstracellulære proteinaggregater og polymerforurening^10,11. Immunoaffinitetsfangstbaserede metoder kræver dyre antistoffer med varierende specificitet samt har problemer med lavt behandlingsvolumen og giver^12,13,14. Partikelstørrelse er en af hovedindikatorerne til evaluering af renheden af isoleret sEV. Selvom sEV-renhed forbliver et uopnåeligt mål, fjerner SEC en betydelig mængde mediumkomponenter, og sEV-partiklerne ekstraheret ved SEC-metoden ligger hovedsageligt i området 50-200 nm¹⁵. De eksisterende teknikker har nogle få ulemper, herunder, men ikke begrænset til, at være tidskrævende, lav renhed, lavt udbytte, dårlig reproducerbarhed, lav gennemstrømning af prøver og potentiel skade på sEV, hvilket gør det uforeneligt med klinisk udnyttelse¹⁶. Således er en hurtig, billig og størrelsesspecificeret sEV-isoleringsmetode, der gælder for forskellige biofluider, et væsentligt behov i flere forsknings- og kliniske situationer.

I flowcytometri analyseres enkeltpartikler på en multiparametrisk måde med høj kapacitet, og delmængder sorteres ud¹⁷. På grund af EV’ernes heterogenitet ville en cytometrisk måling af enkeltpartikelflow være ideel, som er blevet brugt til at undersøge EV’er efter paradigmerne for celleanalyse, hvor lyssprednings- og fluorescensetiketter bruges til at identificere fysiologirelaterede egenskaber og proteinkomponenter^18,19,20. Ikke desto mindre udfordres konventionel flowcytometri af den lille størrelse af sEV og lav overflod af overfladebiomarkører. Følsomheden af flowcytometri kan forbedres ved at optimere detektionsparametre for at skelne baggrundsstøj og sEV uanset brug af fremadrettet spredning (FSC), sidespredning (SSC) eller fluorescenstærskeludløsende parameter¹⁹.

Med den nuværende protokol blev flowcytometriske sorteringsindstillinger med høj opløsning optimeret ved hjælp af fluorescerende perler som standard. Ved at vælge den korrekte dysestørrelse, kappevæsketryk, tærskeludløsningsparameter og spændinger, der styrer spredte lysintensiteter, var vi i stand til at isolere en specifik delmængde af sEV fra en kompleks blanding.

Protocol

1. Cellekultur Forbered et dyrkningsmedium af Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). Dyrk den menneskelige kræftcelle i bugspytkirtlen, PANC-1, i en 75 cm2 kulturkolbe med en densitet på 1 x 106 celler / ml. Kulturen inkuberes ved 37 °C med 5% CO2. Subkultur cellerne, når celletætheden når 75% -80% under mikroskopisk observation. Fjern mediet, og skyl 2x med 3-5 ml fosfatbuffersaltvand (PBS; 0,01 M…

Representative Results

Rutediagrammet for forsøgsprotokollen er vist i figur 1. I denne metode blev polystyrenmikrosfærer i standardstørrelse anvendt som referencestandarder for partikelstørrelsesfordeling. Under den specifikke instrumentparameterbetingelse kunne partikelsignalet tydeligt skelnes fra baggrundsstøjen i FSC vs. SSC-plottet ved hjælp af den logaritmiske form. Gating strategier er vist i figur 2. R4, R5 og R6 henviser til positionerne for henholdsvis 100 nm, 200 nm …

Discussion

Denne protokol skitserer en optimeret metode til at isolere og rense sEV med den specificerede partikelstørrelse på 50-200 nm ved hjælp af en flowcellesorterer, som blev valideret af NTA. Metoden løste flaskehalsproblemet med at opnå sEV med ensartet partikelstørrelse og høj renhed og undgå interferens fra ikke-relaterede biologiske molekyler pakket ind i store elbiler²². Hurtige analyser med høj kapacitet er mulige med flowcytometri, som kan fange 100.000 partikler pr. sekund og træffe …

Materials

Centrifuge tube	Beckman Coulter	344058
Culture flasks	Corning	430641
Dulbecco’s modified eagle medium	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal bovine serum	SUER	SUER050QY
Flow cell sorter	Beckman Coulter	Moflo Astrios EQ
Human pancreatic cancer cell, PANC-1	NA	NA	PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University
Laser particle size and zeta potential analyzer	Malvern	Zetasizer Nano ZS 90
Phosphate buffer saline	Gibco	C20012500BT
Polystyrene fluorescent microspheres	Beckman Coulter	6602336
Transmission electron microscopy	JEOL	JEM-1200EX
Trypsin-EDTA solution	Gibco	1713949
Ultra rainbow fluorescent particles	Beckman Coulter	B28479
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima-L80XP
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW32TI