Denne protokol giver en hurtig og størrelsesspecifik isoleringsmetode til små ekstracellulære vesikler ved at optimere størrelsen på luftsprøjtedysen, kappevæsketrykket, prøveflowtrykket, spændingen, forstærkningen og udløsningstærskelparametrene.
Små ekstracellulære vesikler (sEV) kan frigives fra alle celletyper og bære protein, DNA og RNA. Signalmolekyler tjener som indikatorer for en celles fysiologiske og patologiske tilstand. Der findes imidlertid ingen standardmetode til sEV-isolering, som forhindrer downstream-biomarkøridentifikation og lægemiddelinterventionsundersøgelser. I denne artikel giver vi en detaljeret protokol til isolering og oprensning af 50-200 nm sEV ved hjælp af en flowcellesorterer. Til dette blev der valgt en 50 μm dyse og 80 psi kappevæsketryk for at opnå en god sorteringshastighed og stabil sidestrøm. Standardstørrelse polystyrenmikrosfærer blev brugt til at lokalisere populationer af 100, 200 og 300 nm partikler. Med yderligere optimering af udløsertærsklen for spænding, forstærkning og fremadspredning (FSC) kunne sEV-signalet adskilles fra baggrundsstøjen. Disse optimeringer giver et panel af kritiske sorteringsindstillinger, der gør det muligt at opnå en repræsentativ population af sEV udelukkende ved hjælp af FSC vs. side scatter (SSC). Den flowcytometribaserede isolationsmetode giver ikke kun mulighed for analyse med høj kapacitet, men giver også mulighed for synkron klassificering eller proteomanalyse af sEV baseret på biomarkørekspressionen, hvilket åbner adskillige downstream-forskningsapplikationer.
En celle frigiver ekstracellulære vesikler (EV’er) af forskellig størrelse, der resulterer i signalmolekyler og membranindeslutninger, som er vigtige for intercellulær kommunikation1. EV’er i forskellige størrelser spiller også forskellige biologiske roller, hvor 50-200 nm sEV er i stand til præcist at distribuere RNA, DNA og proteiner til den korrekte ekstracellulære placering. SEV hjælper også med at bestemme deres sekretionsmekanismer, der ikke kun involverer regulering af normale fysiologiske processer såsom immunovervågning, stamcellevedligeholdelse, blodkoagulation og vævsreparation, men også patologien bag flere sygdomme såsom tumorprogression og metastase 2,3. Effektiv isolering og analyse af sEV er afgørende for at identificere biomarkører og designe fremtidige lægemiddelinterventioner.
Med kontinuerlig forskning i den kliniske anvendelse af sEV har isolationsmetoderne for sEV fremsat højere krav. På grund af heterogeniteten af sEV i størrelse, kilde og indhold samt deres lighed med andre EV’er i fysisk-kemiske og biokemiske egenskaber er der ingen standardmetode til sEV-isolering 4,5. I øjeblikket er ultracentrifugering, størrelsesekskluderingskromatografi (SEC), polymerudfældning og immunoaffinitetsindfangning de mest almindelige sEV-isolationsmetoder6. Ultracentrifugering er stadig guldstandarden for sEV-isolering i forskning, på trods af at det er tidskrævende, hvilket resulterer i lav renhed med en bred størrelsesfordeling på 40-500 nm og betydelig mekanisk skade på sEV efter langvarig centrifugering 7,8,9. Polymerudfældning, som normalt bruger polyethylenglycol (PEG), lider af uacceptabel renhed til efterfølgende funktionel analyse med samtidig udfældning af ekstracellulære proteinaggregater og polymerforurening10,11. Immunoaffinitetsfangstbaserede metoder kræver dyre antistoffer med varierende specificitet samt har problemer med lavt behandlingsvolumen og giver12,13,14. Partikelstørrelse er en af hovedindikatorerne til evaluering af renheden af isoleret sEV. Selvom sEV-renhed forbliver et uopnåeligt mål, fjerner SEC en betydelig mængde mediumkomponenter, og sEV-partiklerne ekstraheret ved SEC-metoden ligger hovedsageligt i området 50-200 nm15. De eksisterende teknikker har nogle få ulemper, herunder, men ikke begrænset til, at være tidskrævende, lav renhed, lavt udbytte, dårlig reproducerbarhed, lav gennemstrømning af prøver og potentiel skade på sEV, hvilket gør det uforeneligt med klinisk udnyttelse16. Således er en hurtig, billig og størrelsesspecificeret sEV-isoleringsmetode, der gælder for forskellige biofluider, et væsentligt behov i flere forsknings- og kliniske situationer.
I flowcytometri analyseres enkeltpartikler på en multiparametrisk måde med høj kapacitet, og delmængder sorteres ud17. På grund af EV’ernes heterogenitet ville en cytometrisk måling af enkeltpartikelflow være ideel, som er blevet brugt til at undersøge EV’er efter paradigmerne for celleanalyse, hvor lyssprednings- og fluorescensetiketter bruges til at identificere fysiologirelaterede egenskaber og proteinkomponenter18,19,20. Ikke desto mindre udfordres konventionel flowcytometri af den lille størrelse af sEV og lav overflod af overfladebiomarkører. Følsomheden af flowcytometri kan forbedres ved at optimere detektionsparametre for at skelne baggrundsstøj og sEV uanset brug af fremadrettet spredning (FSC), sidespredning (SSC) eller fluorescenstærskeludløsende parameter19.
Med den nuværende protokol blev flowcytometriske sorteringsindstillinger med høj opløsning optimeret ved hjælp af fluorescerende perler som standard. Ved at vælge den korrekte dysestørrelse, kappevæsketryk, tærskeludløsningsparameter og spændinger, der styrer spredte lysintensiteter, var vi i stand til at isolere en specifik delmængde af sEV fra en kompleks blanding.
Denne protokol skitserer en optimeret metode til at isolere og rense sEV med den specificerede partikelstørrelse på 50-200 nm ved hjælp af en flowcellesorterer, som blev valideret af NTA. Metoden løste flaskehalsproblemet med at opnå sEV med ensartet partikelstørrelse og høj renhed og undgå interferens fra ikke-relaterede biologiske molekyler pakket ind i store elbiler22. Hurtige analyser med høj kapacitet er mulige med flowcytometri, som kan fange 100.000 partikler pr. sekund og træffe …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af den videnskabelige forskningsfond ved Zhejiang Chinese Medicine University (2020ZG29), det grundlæggende offentlige velfærdsforskningsprojekt i Zhejiang-provinsen (LGF19H150006, LTGY23B070001), projektet fra Zhejiang Provincial Department of Education (Y202147028) og projektet om eksperimentel teknologi fra Zhejiang University Laboratory Department (SJS201712, SYB202130).
Centrifuge tube | Beckman Coulter | 344058 | |
Culture flasks | Corning | 430641 | |
Dulbecco’s modified eagle medium | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
Fetal bovine serum | SUER | SUER050QY | |
Flow cell sorter | Beckman Coulter | Moflo Astrios EQ | |
Human pancreatic cancer cell, PANC-1 | NA | NA | PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University |
Laser particle size and zeta potential analyzer | Malvern | Zetasizer Nano ZS 90 | |
Phosphate buffer saline | Gibco | C20012500BT | |
Polystyrene fluorescent microspheres | Beckman Coulter | 6602336 | |
Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-1200EX | |
Trypsin-EDTA solution | Gibco | 1713949 | |
Ultra rainbow fluorescent particles | Beckman Coulter | B28479 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima-L80XP | |
Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW32TI |