Optimalisatie van flowcytometrische sorteerparameters voor isolatie met hoge doorvoer en zuivering van kleine extracellulaire blaasjes

Summary

Dit protocol biedt een snelle en groottespecifieke isolatiemethode voor kleine extracellulaire blaasjes door de grootte van de luchtsproeikop te optimaliseren, de druk van de mantelvloeistof, de druk van de monsterstroom, de spanning, versterking en triggerdrempelparameters.

Abstract

Kleine extracellulaire blaasjes (sEV) kunnen worden vrijgegeven uit alle celtypen en dragen eiwit, DNA en RNA. Signaalmoleculen dienen als indicatoren van de fysiologische en pathologische toestand van een cel. Er is echter geen standaardmethode voor sEV-isolatie, die downstream biomarkeridentificatie en geneesmiddelinterventiestudies voorkomt. In dit artikel geven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie en zuivering van 50-200 nm sEV door een flowcelsorteerder. Hiervoor werd gekozen voor een mondstuk van 50 μm en een mantelvloeistofdruk van 80 psi om een goede sorteersnelheid en een stabiele zijstroom te verkrijgen. Polystyreenmicrosferen van standaardformaat werden gebruikt om populaties van deeltjes van 100, 200 en 300 nm te lokaliseren. Met extra optimalisatie van de spannings-, versterkings- en forward scatter (FSC) triggering threshold, kon het sEV-signaal worden gescheiden van de achtergrondruis. Deze optimalisaties bieden een paneel met kritieke sorteerinstellingen waarmee men een representatieve populatie van sEV kan verkrijgen met alleen FSC versus side scatter (SSC). De op flowcytometrie gebaseerde isolatiemethode maakt niet alleen analyse met hoge doorvoer mogelijk, maar maakt ook synchrone classificatie of proteoomanalyse van sEV mogelijk op basis van de biomarkerexpressie, waardoor tal van downstream-onderzoekstoepassingen worden geopend.

Introduction

Een cel geeft extracellulaire blaasjes (EV’s) van verschillende groottes af die resulteren in signaalmoleculen en membraaninsluitsels, die belangrijk zijn voor intercellulaire communicatie¹. EV’s van verschillende groottes spelen ook verschillende biologische rollen, waarbij 50-200 nm sEV in staat is om RNA, DNA en eiwitten nauwkeurig te verdelen naar de juiste extracellulaire locatie. De sEV helpt ook bij het bepalen van hun secretiemechanismen, waarbij niet alleen de regulatie van normale fysiologische processen zoals immuunsurveillance, stamcelonderhoud, bloedstolling en weefselherstel betrokken is, maar ook de pathologie die ten grondslag ligt aan verschillende ziekten zoals tumorprogressie en metastase ^2,3. Effectieve isolatie en analyse van sEV zijn van cruciaal belang voor het identificeren van biomarkers en het ontwerpen van toekomstige medicijninterventies.

Met continu onderzoek naar de klinische toepassing van sEV hebben de isolatiemethoden van sEV hogere eisen gesteld. Vanwege de heterogeniteit van sEV in grootte, bron en inhoud, evenals hun gelijkenis met andere EV’s in fysisch-chemische en biochemische eigenschappen, is er geen standaardmethode voor sEV-isolatie ^4,5. Momenteel zijn ultracentrifugatie, grootte-uitsluitingschromatografie (SEC), polymeerprecipitatie en immunoaffiniteitsafvang de meest voorkomende sEV-isolatiemethoden⁶. Ultracentrifugatie is nog steeds de gouden standaard voor sEV-isolatie in onderzoek, ondanks dat het tijdrovend is, wat resulteert in een lage zuiverheid met een brede grootteverdeling van 40-500 nm en aanzienlijke mechanische schade aan de sEV na langdurige centrifugatie ^7,8,9. Polymeerprecipitatie, waarbij meestal polyethyleenglycol (PEG) wordt gebruikt, lijdt aan onaanvaardbare zuiverheid voor latere functionele analyse met gelijktijdige precipitatie van extracellulaire eiwitaggregaten en polymeerverontreiniging^10,11. Op immunoaffiniteitsvangst gebaseerde methoden vereisen dure antilichamen met verschillende specificiteit, evenals problemen met een laag verwerkingsvolume en opbrengsten^{van 12,13,14}. Deeltjesgrootte is een van de belangrijkste indicatoren om de zuiverheid van geïsoleerde sEV te evalueren. Hoewel sEV-zuiverheid een onbereikbaar doel blijft, verwijdert SEC een aanzienlijke hoeveelheid mediumcomponenten en liggen de sEV-deeltjes die met de SEC-methode worden geëxtraheerd voornamelijk in het bereik van 50-200 nm¹⁵. De bestaande technieken hebben een paar nadelen, waaronder maar niet beperkt tot tijdrovend, lage zuiverheid, lage opbrengst, slechte reproduceerbaarheid, lage doorvoer van monsters en potentiële schade aan sEV, waardoor het onverenigbaar is met klinisch gebruik¹⁶. Een snelle, goedkope en op maat gespecificeerde sEV-isolatiemethode die van toepassing is op diverse biovloeistoffen is dus een essentiële behoefte in verschillende onderzoeks- en klinische situaties.

In flowcytometrie worden afzonderlijke deeltjes geanalyseerd op een multiparametrische manier met hoge doorvoer en worden subsets gesorteerd¹⁷. Vanwege de heterogeniteit van EV’s zou een cytometrische meting van één deeltjesstroom ideaal zijn, die is gebruikt om EV’s te onderzoeken volgens de paradigma’s van celanalyse, waarbij lichtverstrooiings- en fluorescentielabels worden gebruikt om fysiologiegerelateerde kenmerken en eiwitcomponenten te identificeren^18,19,20. Niettemin wordt conventionele flowcytometrie uitgedaagd door de kleine omvang van sEV en de lage abundantie van oppervlaktebiomarkers. De gevoeligheid van flowcytometrie kan worden verbeterd door detectieparameters te optimaliseren om achtergrondgeluid en sEV te onderscheiden, ongeacht het gebruik van forward scatter (FSC), side scatter (SSC) of fluorescentiedrempel triggering parameter¹⁹.

Met het huidige protocol werden hoge resolutie flowcytometrische sorteerinstellingen geoptimaliseerd met standaard fluorescerende kralen. Door de juiste spuitmondgrootte, de druk van de mantelvloeistof, de drempeltriggerparameter en spanningen te selecteren die de intensiteit van het verstrooide licht regelen, konden we een specifieke subset van sEV isoleren van een complex mengsel.

Protocol

1. Celkweek Bereid een kweekmedium van Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS). Kweek de menselijke alvleesklierkankercel, PANC-1, in een 75 cm2 kweekkolf met een dichtheid van 1 x 106 cellen/ml. Incubeer de cultuur bij 37 °C met 5% CO2. Subcultuur de cellen wanneer de celdichtheid 75% -80% bereikt onder microscopische observatie. Verwijder het medium en spoel 2x met 3-5 ml fosfaatbufferzoutoplossing (PBS; 0…

Representative Results

Het stroomdiagram voor het experimentele protocol is weergegeven in figuur 1. Bij deze methode werden polystyreenmicrosferen van standaardgrootte gebruikt als referentiestandaarden voor de verdeling van de deeltjesgrootte. Onder de specifieke instrumentele parameterconditie kon het deeltjessignaal duidelijk worden onderscheiden van de achtergrondruis in de FSC vs. SSC-plot met behulp van de logaritmische vorm. Gatingstrategieën zijn weergegeven in figuur 2. R4,…

Discussion

Dit protocol schetst een geoptimaliseerde methode om sEV te isoleren en te zuiveren met de gespecificeerde deeltjesgrootte van 50-200 nm met behulp van een flowcelsorteerder, die werd gevalideerd door NTA. De methode loste het knelpuntprobleem op van het verkrijgen van sEV met uniforme deeltjesgrootte en hoge zuiverheid, waarbij interferentie van niet-gerelateerde biologische moleculen verpakt in grote EV’s^{werd vermeden 22}. Snelle, high-throughput analyses zijn mogelijk met flowcytometrie, die 100…

Materials

Centrifuge tube	Beckman Coulter	344058
Culture flasks	Corning	430641
Dulbecco’s modified eagle medium	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal bovine serum	SUER	SUER050QY
Flow cell sorter	Beckman Coulter	Moflo Astrios EQ
Human pancreatic cancer cell, PANC-1	NA	NA	PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University
Laser particle size and zeta potential analyzer	Malvern	Zetasizer Nano ZS 90
Phosphate buffer saline	Gibco	C20012500BT
Polystyrene fluorescent microspheres	Beckman Coulter	6602336
Transmission electron microscopy	JEOL	JEM-1200EX
Trypsin-EDTA solution	Gibco	1713949
Ultra rainbow fluorescent particles	Beckman Coulter	B28479
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima-L80XP
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW32TI