Optimisation des paramètres de tri cytométrique en flux pour l’isolation et la purification à haut débit de petites vésicules extracellulaires

Summary

Ce protocole fournit une méthode d’isolation rapide et spécifique à la taille pour les petites vésicules extracellulaires en optimisant la taille de la buse de pulvérisation d’air, la pression du fluide de gaine, la pression d’écoulement de l’échantillon, la tension, le gain et les paramètres de seuil de déclenchement.

Abstract

Les petites vésicules extracellulaires (sEV) peuvent être libérées de tous les types de cellules et transporter des protéines, de l’ADN et de l’ARN. Les molécules de signalisation servent d’indicateurs de l’état physiologique et pathologique d’une cellule. Cependant, il n’existe pas de méthode standard pour l’isolement des EV, ce qui empêche l’identification des biomarqueurs en aval et les études d’intervention médicamenteuse. Dans cet article, nous fournissons un protocole détaillé pour l’isolation et la purification de 50-200 nm sEV par un trieur de cellules d’écoulement. Pour cela, une buse de 50 μm et une pression de fluide de gaine de 80 psi ont été sélectionnées pour obtenir un bon taux de tri et un flux latéral stable. Des microsphères de polystyrène de taille standard ont été utilisées pour localiser des populations de particules de 100, 200 et 300 nm. Avec une optimisation supplémentaire du seuil de déclenchement de la tension, du gain et de la diffusion directe (FSC), le signal sEV pourrait être séparé du bruit de fond. Ces optimisations fournissent un panel de paramètres de tri critiques qui permet d’obtenir une population représentative de sEV en utilisant uniquement FSC vs diffusion latérale (SSC). La méthode d’isolation basée sur la cytométrie en flux permet non seulement une analyse à haut débit, mais permet également une classification synchrone ou une analyse protéome de sEV basée sur l’expression du biomarqueur, ouvrant de nombreuses applications de recherche en aval.

Introduction

Une cellule libère des vésicules extracellulaires (VE) de différentes tailles qui entraînent des molécules de signalisation et des inclusions membranaires, ce qui est important pour la communication intercellulaire¹. Les VE de différentes tailles jouent également différents rôles biologiques, avec 50-200 nm sEV pouvant distribuer avec précision l’ARN, l’ADN et les protéines au bon emplacement extracellulaire. Le sEV aide également à déterminer leurs mécanismes de sécrétion, impliquant non seulement la régulation des processus physiologiques normaux tels que la surveillance immunitaire, le maintien des cellules souches, la coagulation sanguine et la réparation des tissus, mais aussi la pathologie sous-jacente à plusieurs maladies telles que la progression tumorale et les métastases ^2,3. L’isolement et l’analyse efficaces de la sEV sont essentiels pour identifier les biomarqueurs et concevoir de futures interventions médicamenteuses.

Avec la recherche continue sur l’application clinique de sEV, les méthodes d’isolement de sEV ont mis en avant des exigences plus élevées. En raison de l’hétérogénéité des EV en termes de taille, de source et de contenu, ainsi que de leur similitude avec d’autres EV dans les propriétés physico-chimiques et biochimiques, il n’existe pas de méthode standard pour l’isolement des EV ^4,5. Actuellement, l’ultracentrifugation, la chromatographie d’exclusion de taille (SEC), la précipitation par polymère et la capture d’immunoaffinité sont les méthodes d’isolation sEV les plus courantes⁶. L’ultracentrifugation est toujours l’étalon-or pour l’isolation des EV dans la recherche, bien qu’elle prenne beaucoup de temps, ce qui entraîne une faible pureté avec une large distribution de taille de 40 à 500 nm et des dommages mécaniques importants au sEV après une centrifugation à long terme ^7,8,9. La précipitation des polymères, qui utilise habituellement du polyéthylène glycol (PEG), souffre d’une pureté inacceptable pour l’analyse fonctionnelle ultérieure avec précipitation concomitante d’agrégats de protéines extracellulaires et contamination par les polymères^10,11. Les méthodes basées sur la capture d’immunoaffinité nécessitent des anticorps coûteux avec des spécificités variables, ainsi que des problèmes de faible volume de traitement et de rendements^12,13,14. La taille des particules est l’un des principaux indicateurs pour évaluer la pureté du sEV isolé. Bien que la pureté du sEV reste un objectif inaccessible, la SEC élimine une quantité considérable de composants du milieu, et les particules de sEV extraites par la méthode SEC sont principalement comprises entre 50 et 200 nm¹⁵. Les techniques existantes présentent quelques inconvénients, y compris, mais sans s’y limiter, le fait qu’elles prennent beaucoup de temps, qu’elles soient peu pures, à faible rendement, à faible reproductibilité, à faible débit d’échantillons et à des dommages potentiels de sEV, ce qui les rend incompatibles avec l’utilisation clinique¹⁶. Ainsi, une méthode d’isolation de la SVE rapide, peu coûteuse et de taille spécifiée applicable à divers biofluides est un besoin essentiel dans plusieurs situations cliniques et de recherche.

En cytométrie en flux, les particules uniques sont analysées de manière multiparamétrique à haut débit et les sous-ensembles sont triés¹⁷. En raison de l’hétérogénéité des VE, une mesure cytométrique en flux de particules uniques serait idéale, qui a été utilisée pour étudier les VE suivant les paradigmes de l’analyse cellulaire, avec des marqueurs de diffusion de la lumière et de fluorescence utilisés pour identifier les caractéristiques liées à la physiologie et les composants protéiques^18,19,20. Néanmoins, la cytométrie de flux conventionnelle est remise en question par la petite taille de sEV et la faible abondance de biomarqueurs de surface. La sensibilité de la cytométrie en flux pourrait être améliorée en optimisant les paramètres de détection pour distinguer le bruit de fond et le sEV, indépendamment de l’utilisation du paramètre de déclenchement de la diffusion directe (FSC), de la diffusion latérale (SSC) ou du seuil de fluorescence¹⁹.

Avec le protocole actuel, les paramètres de tri cytométrique en flux à haute résolution ont été optimisés en utilisant des billes fluorescentes en standard. En sélectionnant la taille de buse, la pression du fluide de gaine, le paramètre de déclenchement du seuil et les tensions contrôlant les intensités lumineuses diffusées, nous avons pu isoler un sous-ensemble spécifique de sEV d’un mélange complexe.

Protocol

1. Culture cellulaire Préparer un milieu de culture de milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS). Culture de la cellule cancéreuse du pancréas humain, PANC-1, dans une fiole de culture de 75 cm2 à une densité de 1 x 106 cellules/mL. Incuber la culture à 37 °C avec 5% de CO2. Sous-culture des cellules lorsque la densité cellulaire atteint 75%-80% sous observation microscopique. Retirer le milieu et…

Representative Results

L’organigramme du protocole expérimental est illustré à la figure 1. Dans cette méthode, des microsphères de polystyrène de taille standard ont été utilisées comme étalons de référence pour la distribution granulométrique. Dans la condition spécifique du paramètre instrumental, le signal de particules a pu être clairement distingué du bruit de fond dans le diagramme FSC vs SSC en utilisant la forme logarithmique. Les stratégies d’établissement de points de contrôle so…

Discussion

Ce protocole décrit une méthode optimisée pour isoler et purifier le sEV avec la taille de particules spécifiée de 50 à 200 nm à l’aide d’un trieur de cellules d’écoulement, qui a été validé par NTA. La méthode a résolu le problème du goulot d’étranglement consistant à obtenir du sEV avec une taille de particules uniforme et une grande pureté, évitant ainsi les interférences de molécules biologiques non apparentées enveloppées dans des VE de grande taille²². Des analy…

Materials

Centrifuge tube	Beckman Coulter	344058
Culture flasks	Corning	430641
Dulbecco’s modified eagle medium	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal bovine serum	SUER	SUER050QY
Flow cell sorter	Beckman Coulter	Moflo Astrios EQ
Human pancreatic cancer cell, PANC-1	NA	NA	PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University
Laser particle size and zeta potential analyzer	Malvern	Zetasizer Nano ZS 90
Phosphate buffer saline	Gibco	C20012500BT
Polystyrene fluorescent microspheres	Beckman Coulter	6602336
Transmission electron microscopy	JEOL	JEM-1200EX
Trypsin-EDTA solution	Gibco	1713949
Ultra rainbow fluorescent particles	Beckman Coulter	B28479
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima-L80XP
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW32TI