Optimierung der durchflusszytometrischen Sortierparameter für die Hochdurchsatzisolierung und Aufreinigung kleiner extrazellulärer Vesikel

Summary

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und größenspezifische Isolationsmethode für kleine extrazelluläre Vesikel, indem die Größe der Luftsprühdüse, der Mantelflüssigkeitsdruck, der Probenflussdruck, die Spannung, die Verstärkung und die Auslöseschwellenparameter optimiert werden.

Abstract

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEV) können aus allen Zelltypen freigesetzt werden und Proteine, DNA und RNA tragen. Signalmoleküle dienen als Indikatoren für den physiologischen und pathologischen Zustand einer Zelle. Es gibt jedoch keine Standardmethode für die sEV-Isolierung, die nachgeschaltete Biomarker-Identifizierungs- und Arzneimittelinterventionsstudien verhindert. In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Reinigung von 50-200 nm sEV durch einen Durchflusszellensortierer zur Verfügung. Zu diesem Zweck wurden eine 50-μm-Düse und ein Mantelflüssigkeitsdruck von 80 psi gewählt, um eine gute Sortierrate und einen stabilen Seitenstrom zu erzielen. Polystyrol-Mikrokugeln in Standardgröße wurden verwendet, um Populationen von 100-, 200- und 300-nm-Partikeln zu lokalisieren. Durch eine zusätzliche Optimierung der Auslöseschwelle für Spannung, Verstärkung und Vorwärtsstreuung (FSC) konnte das sEV-Signal vom Hintergrundrauschen getrennt werden. Diese Optimierungen bieten einen Bereich kritischer Sortiereinstellungen, der es ermöglicht, eine repräsentative Population von sEV nur mit FSC vs. Side Scatter (SSC) zu erhalten. Die auf Durchflusszytometrie basierende Isolationsmethode ermöglicht nicht nur eine Hochdurchsatzanalyse, sondern auch eine synchrone Klassifizierung oder Proteomanalyse von sEV basierend auf der Biomarkerexpression, was zahlreiche nachgelagerte Forschungsanwendungen eröffnet.

Introduction

Eine Zelle setzt extrazelluläre Vesikel (EVs) unterschiedlicher Größe frei, die zu Signalmolekülen und Membraneinschlüssen führen, die für die interzelluläre Kommunikation wichtig sind¹. EVs unterschiedlicher Größe spielen auch unterschiedliche biologische Rollen, wobei 50-200 nm sEV in der Lage sind, RNA, DNA und Proteine präzise an die richtige extrazelluläre Stelle zu verteilen. Die sEV hilft auch bei der Bestimmung ihrer Sekretionsmechanismen, die nicht nur die Regulierung normaler physiologischer Prozesse wie Immunüberwachung, Stammzellerhaltung, Blutgerinnung und Gewebereparatur umfassen, sondern auch die Pathologie, die verschiedenen Krankheiten wie Tumorprogression und Metastasierung zugrunde liegt ^2,3. Eine effektive Isolierung und Analyse von sEV ist entscheidend für die Identifizierung von Biomarkern und die Entwicklung zukünftiger medikamentöser Interventionen.

Mit kontinuierlicher Forschung zur klinischen Anwendung von sEV haben die Isolationsmethoden von sEV höhere Anforderungen gestellt. Aufgrund der Heterogenität von sEV in Größe, Quelle und Gehalt sowie ihrer Ähnlichkeit mit anderen EVs in Bezug auf physikalisch-chemische und biochemische Eigenschaften gibt es keine Standardmethode für die sEV-Isolierung ^4,5. Derzeit sind Ultrazentrifugation, Größenausschlusschromatographie (SEC), Polymerfällung und Immunaffinitätserfassung die gebräuchlichsten sEV-Isolationsmethoden⁶. Die Ultrazentrifugation ist nach wie vor der Goldstandard für die sEV-Isolierung in der Forschung, obwohl sie zeitaufwändig ist, was zu einer geringen Reinheit mit einer breiten Größenverteilung von 40-500 nm und einer signifikanten mechanischen Schädigung des sEV nach Langzeitzentrifugation führt ^7,8,9. Die Polymerfällung, bei der üblicherweise Polyethylenglykol (PEG) verwendet wird, weist eine inakzeptable Reinheit für die anschließende Funktionsanalyse mit gleichzeitiger Ausfällung extrazellulärer Proteinaggregate und Polymerkontamination^{auf 10,11}. Immunaffinitäts-Capture-basierte Methoden erfordern teure Antikörper mit unterschiedlicher Spezifität sowie Probleme mit geringem Verarbeitungsvolumen und Ausbeuten^12,13,14. Die Partikelgröße ist einer der Hauptindikatoren zur Bewertung der Reinheit von isoliertem sEV. Obwohl die Reinheit von sEV nach wie vor ein unerreichbares Ziel ist, entfernt SEC eine beträchtliche Menge an Medienkomponenten, und die mit der SEC-Methode extrahierten sEV-Partikel liegen hauptsächlich im Bereich von 50-200 nm¹⁵. Die bestehenden Techniken weisen einige Nachteile auf, darunter Zeitaufwand, geringe Reinheit, geringe Ausbeute, schlechte Reproduzierbarkeit, geringer Probendurchsatz und potenzielle Schädigung von sEV, was sie mit der klinischen Anwendung unvereinbar macht¹⁶. Daher ist eine schnelle, kostengünstige und größenspezifische sEV-Isolationsmethode, die auf verschiedene Biofluide anwendbar ist, ein wesentlicher Bedarf in verschiedenen Forschungs- und klinischen Situationen.

In der Durchflusszytometrie werden einzelne Partikel multiparametrisch mit hohem Durchsatz analysiert und Teilmengen aussortiert¹⁷. Aufgrund der Heterogenität von EVs wäre eine durchflusszytometrische Einzelpartikelmessung ideal, die zur Untersuchung von EVs nach den Paradigmen der Zellanalyse verwendet wurde, wobei Lichtstreu- und Fluoreszenzmarkierungen verwendet wurden, um physiologische Merkmale und Proteinkomponenten zu identifizieren^18,19,20. Nichtsdestotrotz wird die konventionelle Durchflusszytometrie durch die geringe Größe von sEV und die geringe Häufigkeit von Oberflächenbiomarkern herausgefordert. Die Sensitivität der Durchflusszytometrie könnte verbessert werden, indem die Detektionsparameter optimiert werden, um Hintergrundrauschen und sEV zu unterscheiden, unabhängig davon, ob Vorwärtsstreuung (FSC), Seitenstreuung (SSC) oder Fluoreszenzschwellen-Auslöseparameter¹⁹ verwendet werden.

Mit dem vorliegenden Protokoll wurden hochauflösende durchflusszytometrische Sortiereinstellungen unter Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen als Standard optimiert. Durch die Auswahl der richtigen Düsengröße, des Mantelflüssigkeitsdrucks, des Schwellenwert-Auslöseparameters und der Spannungen, die die Streulichtintensität steuern, konnten wir eine bestimmte Teilmenge von sEV aus einem komplexen Gemisch isolieren.

Protocol

1. Zellkultur Bereiten Sie ein Nährmedium aus Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) vor, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wird. Die menschliche Bauchspeicheldrüsenkrebszelle PANC-1 wird in einem 75cm2 Kulturkolben mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen/ml kultiviert. Inkubation der Kultur bei 37 °C mit 5% CO2. Subkultur der Zellen, wenn die Zelldichte unter mikroskopischer Beobachtung 75%-80% erreicht. Entfernen Sie das Medium und spül…

Representative Results

Das Flussdiagramm für das experimentelle Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Bei diesem Verfahren wurden Polystyrol-Mikrokugeln in Standardgröße als Referenzstandards für die Partikelgrößenverteilung verwendet. Unter der spezifischen instrumentellen Parameterbedingung konnte das Partikelsignal mit Hilfe der logarithmischen Form klar vom Hintergrundrauschen im FSC- vs. SSC-Diagramm unterschieden werden. Gating-Strategien sind in Abbildung 2 dargestell…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Isolierung und Aufreinigung von sEV mit der spezifizierten Partikelgröße von 50-200 nm unter Verwendung eines Durchflusszellensortierers, der von NTA validiert wurde. Die Methode löste das Engpassproblem, sEV mit einheitlicher Partikelgröße und hoher Reinheit zu erhalten, und verhinderte Interferenzen durch nicht verwandte biologische Moleküle, die in großformatige EVs^{eingewickelt sind 22}. Schnelle Hochdurchsatzanalysen sind mit der Du…

Materials

Centrifuge tube	Beckman Coulter	344058
Culture flasks	Corning	430641
Dulbecco’s modified eagle medium	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal bovine serum	SUER	SUER050QY
Flow cell sorter	Beckman Coulter	Moflo Astrios EQ
Human pancreatic cancer cell, PANC-1	NA	NA	PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University
Laser particle size and zeta potential analyzer	Malvern	Zetasizer Nano ZS 90
Phosphate buffer saline	Gibco	C20012500BT
Polystyrene fluorescent microspheres	Beckman Coulter	6602336
Transmission electron microscopy	JEOL	JEM-1200EX
Trypsin-EDTA solution	Gibco	1713949
Ultra rainbow fluorescent particles	Beckman Coulter	B28479
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima-L80XP
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW32TI