उच्च-थ्रूपुट अलगाव और छोटे बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के शुद्धिकरण के लिए फ्लो साइटोमेट्रिक सॉर्टिंग मापदंडों का अनुकूलन
Summary
यह प्रोटोकॉल एयर स्प्रे नोजल, शीथ द्रव दबाव, नमूना प्रवाह दबाव, वोल्टेज, लाभ और ट्रिगरिंग थ्रेशोल्ड मापदंडों के आकार को अनुकूलित करके छोटे बाह्य पुटिकाओं के लिए एक तेजी से और आकार-विशिष्ट अलगाव विधि प्रदान करता है।
Abstract
छोटे बाह्य पुटिकाओं (एसईवी) को सभी सेल प्रकारों से जारी किया जा सकता है और प्रोटीन, डीएनए और आरएनए ले जाया जा सकता है। सिग्नलिंग अणु एक कोशिका की शारीरिक और रोग संबंधी स्थिति के संकेतक के रूप में काम करते हैं। हालांकि, एसईवी अलगाव के लिए कोई मानक विधि नहीं है, जो डाउनस्ट्रीम बायोमार्कर पहचान और दवा हस्तक्षेप अध्ययन को रोकती है। इस लेख में, हम एक प्रवाह सेल सॉर्टर द्वारा 50-200 एनएम एसईवी के अलगाव और शुद्धिकरण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इसके लिए, एक अच्छी छंटाई दर और स्थिर साइड स्ट्रीम प्राप्त करने के लिए 50 μm नोजल और 80 psi शीथ द्रव दबाव का चयन किया गया था। मानक आकार के पॉलीस्टाइनिन माइक्रोसेफर्स का उपयोग 100, 200 और 300 एनएम कणों की आबादी का पता लगाने के लिए किया गया था। वोल्टेज, लाभ और फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) ट्रिगरिंग थ्रेसहोल्ड के अतिरिक्त अनुकूलन के साथ, एसईवी सिग्नल को पृष्ठभूमि शोर से अलग किया जा सकता है। ये ऑप्टिमाइज़ेशन महत्वपूर्ण प्रकार सेटिंग्स का एक पैनल प्रदान करते हैं जो केवल एफएससी बनाम साइड स्कैटर (एसएससी) का उपयोग करके एसईवी की प्रतिनिधि आबादी प्राप्त करने में सक्षम बनाता है। फ्लो साइटोमेट्री-आधारित अलगाव विधि न केवल उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण की अनुमति देती है, बल्कि बायोमार्कर अभिव्यक्ति के आधार पर एसईवी के तुल्यकालिक वर्गीकरण या प्रोटिओम विश्लेषण की भी अनुमति देती है, जिससे कई डाउनस्ट्रीम अनुसंधान अनुप्रयोग खुलते हैं।
Introduction
एक कोशिका अलग-अलग आकार के बाह्य पुटिकाओं (ईवी) को जारी करती है जिसके परिणामस्वरूप सिग्नलिंग अणु और झिल्ली समावेशन होते हैं, जो अंतरकोशिकीयसंचार के लिए महत्वपूर्ण हैं। विभिन्न आकारों के ईवी भी अलग-अलग जैविक भूमिका निभाते हैं, जिसमें 50-200 एनएम एसईवी आरएनए, डीएनए और प्रोटीन को सही बाह्य स्थान पर सटीक रूप से वितरित करने में सक्षम है। एसईवी उनके स्राव तंत्र को निर्धारित करने में भी मदद करता है, जिसमें न केवल प्रतिरक्षा निगरानी, स्टेम सेल रखरखाव, रक्त जमावट और ऊतक की मरम्मत जैसी सामान्य शारीरिक प्रक्रियाओं का विनियमन शामिल है, बल्कि ट्यूमर की प्रगति और मेटास्टेसिस 2,3 जैसी कई बीमारियों को अंतर्निहित विकृति भी शामिल है। बायोमाकर्स की पहचान करने और भविष्य के दवा हस्तक्षेपों को डिजाइन करने के लिए एसईवी का प्रभावी अलगाव और विश्लेषण महत्वपूर्ण है।
एसईवी के नैदानिक अनुप्रयोग पर निरंतर शोध के साथ, एसईवी के अलगाव विधियों ने उच्च आवश्यकताओं को आगे बढ़ाया है। आकार, स्रोत और सामग्री में एसईवी की विविधता के साथ-साथ भौतिक रासायनिक और जैव रासायनिक गुणों में अन्य ईवी के साथ उनकी समानता के कारण, एसईवी अलगाव 4,5 के लिए कोई मानक विधि नहीं है। वर्तमान में, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन, आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी), बहुलक वर्षा, और इम्यूनोफिनिटी कैप्चर सबसे आम एसईवीअलगाव विधियां हैं। अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन अभी भी अनुसंधान में एसईवी अलगाव के लिए स्वर्ण मानक है, समय लेने वाला होने के बावजूद, जिसके परिणामस्वरूप 40-500 एनएम के व्यापक आकार के वितरण के साथ कम शुद्धता और दीर्घकालिक सेंट्रीफ्यूजेशन 7,8,9 के बाद एसईवी को महत्वपूर्ण यांत्रिक क्षति होती है। बहुलक वर्षा, जो आमतौर पर पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) का उपयोग करती है, बाह्य प्रोटीन समुच्चय और बहुलक संदूषण10,11 के सहवर्ती वर्षा के साथ बाद के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए अस्वीकार्य शुद्धता से ग्रस्त है। इम्यूनोफिनिटी कैप्चर-आधारित विधियों को अलग-अलग विशिष्टता के साथ उच्च लागत वाले एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है, साथ ही कम प्रसंस्करण मात्रा औरउपज 12,13,14 के साथ समस्याएं होती हैं। कण आकार पृथक एसईवी की शुद्धता का मूल्यांकन करने के लिए मुख्य संकेतकों में से एक है। यद्यपि एसईवी शुद्धता एक अप्राप्य लक्ष्य बनी हुई है, एसईसी मध्यम घटकों की काफी मात्रा को हटा देता है, और एसईसी विधि द्वारा निकाले गए एसईवी कण मुख्य रूप से 50-200 एनएम15 की सीमा में होते हैं। मौजूदा तकनीकों के कुछ नुकसान हैं, जिनमें समय लेने वाली, कम शुद्धता, कम उपज, खराब प्रजनन क्षमता, नमूनों की कम थ्रूपुट और एसईवी की संभावित क्षति शामिल है, जो इसेनैदानिक उपयोग के साथ असंगत बनाती है। इस प्रकार, विभिन्न बायोफ्लुइड्स पर लागू एक तेजी से, सस्ती और आकार-निर्दिष्ट एसईवी अलगाव विधि कई शोध और नैदानिक स्थितियों में एक आवश्यक आवश्यकता है।
फ्लो साइटोमेट्री में, एकल कणों का विश्लेषण उच्च-थ्रूपुट, मल्टीपैरामीट्रिक तरीके से किया जाता है, और उपसमुच्चयको 17 में क्रमबद्ध किया जाता है। ईवी की विविधता के कारण, एक एकल-कण प्रवाह साइटोमेट्रिक माप आदर्श होगा, जिसका उपयोग सेल विश्लेषण के प्रतिमानों के बाद ईवी की जांच करने के लिए किया गया है, जिसमें शरीर विज्ञान से संबंधित विशेषताओं और प्रोटीन घटकों 18,19,20 की पहचान करने के लिए प्रकाश स्कैटर और फ्लोरेसेंस लेबल का उपयोग किया जा रहा है। फिर भी, पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री को एसईवी के छोटे आकार और सतह बायोमाकर्स की कम प्रचुरता से चुनौती दी जाती है। फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी), साइड स्कैटर (एसएससी), या फ्लोरेसेंस थ्रेशोल्ड ट्रिगरिंग पैरामीटर19 का उपयोग किए बिना पृष्ठभूमि शोर और एसईवी को अलग करने के लिए डिटेक्शन मापदंडों को अनुकूलित करके फ्लो साइटोमेट्री की संवेदनशीलता में सुधार किया जा सकता है।
वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ, उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रवाह साइटोमेट्रिक सॉर्ट सेटिंग्स को मानक के रूप में फ्लोरोसेंट मोतियों का उपयोग करके अनुकूलित किया गया था। उचित नोजल आकार, शीथ द्रव दबाव, थ्रेशोल्ड ट्रिगरिंग पैरामीटर और बिखरे हुए प्रकाश तीव्रता को नियंत्रित करने वाले वोल्टेज का चयन करके, हम एक जटिल मिश्रण से एसईवी के एक विशिष्ट उप-समूह को अलग करने में सक्षम थे।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल फ्लो सेल सॉर्टर का उपयोग करके 50-200 एनएम के निर्दिष्ट कण आकार के साथ एसईवी को अलग करने और शुद्ध करने के लिए एक अनुकूलित विधि की रूपरेखा तैयार करता है, जिसे एनटीए द्वारा मान्य किया गया था। विधि ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को झेजियांग चीनी चिकित्सा विश्वविद्यालय (2020जेडजी 29) के वैज्ञानिक अनुसंधान कोष, झेजियांग प्रांत की बुनियादी सार्वजनिक कल्याण अनुसंधान परियोजना (एलजीएफ 19 एच 150006, एलटीजीवाई 23 बी 070001), झेजियांग प्रांतीय शिक्षा विभाग की परियोजना (वाई 202147028) और झेजियांग विश्वविद्यालय प्रयोगशाला विभाग (एसजेएस 201712, एसवाईबी 202020) की प्रायोगिक प्रौद्योगिकी की परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Centrifuge tube | Beckman Coulter | 344058 | |
| Culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s modified eagle medium | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | SUER | SUER050QY | |
| Flow cell sorter | Beckman Coulter | Moflo Astrios EQ | |
| Human pancreatic cancer cell, PANC-1 | NA | NA | PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University |
| Laser particle size and zeta potential analyzer | Malvern | Zetasizer Nano ZS 90 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco | C20012500BT | |
| Polystyrene fluorescent microspheres | Beckman Coulter | 6602336 | |
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-1200EX | |
| Trypsin-EDTA solution | Gibco | 1713949 | |
| Ultra rainbow fluorescent particles | Beckman Coulter | B28479 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima-L80XP | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW32TI |
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