Ottimizzazione dei parametri di selezione citometrica a flusso per l'isolamento e la purificazione ad alta produttività di piccole vescicole extracellulari

Summary

Questo protocollo fornisce un metodo di isolamento rapido e specifico per le dimensioni delle piccole vescicole extracellulari ottimizzando le dimensioni dell’ugello di nebulizzazione dell’aria, la pressione del fluido della guaina, la pressione del flusso del campione, la tensione, il guadagno e i parametri di soglia di attivazione.

Abstract

Le piccole vescicole extracellulari (sEV) possono essere rilasciate da tutti i tipi di cellule e trasportare proteine, DNA e RNA. Le molecole di segnalazione servono come indicatori dello stato fisiologico e patologico di una cellula. Tuttavia, non esiste un metodo standard per l’isolamento di sEV, che impedisce l’identificazione dei biomarcatori a valle e gli studi di intervento farmacologico. In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato per l’isolamento e la purificazione di 50-200 nm sEV da parte di una selezionatrice di celle a flusso. Per questo, sono stati selezionati un ugello da 50 μm e una pressione del fluido della guaina da 80 psi per ottenere una buona velocità di selezione e un flusso laterale stabile. Sono state utilizzate microsfere di polistirene di dimensioni standard per localizzare popolazioni di particelle di 100, 200 e 300 nm. Con un’ulteriore ottimizzazione della soglia di attivazione di tensione, guadagno e diffusione diretta (FSC), il segnale sEV potrebbe essere separato dal rumore di fondo. Queste ottimizzazioni forniscono un pannello di impostazioni di ordinamento critiche che consente di ottenere una popolazione rappresentativa di sEV utilizzando solo FSC vs. side scatter (SSC). Il metodo di isolamento basato sulla citometria a flusso non solo consente l’analisi ad alto rendimento, ma consente anche la classificazione sincrona o l’analisi del proteoma di sEV in base all’espressione del biomarcatore, aprendo numerose applicazioni di ricerca a valle.

Introduction

Una cellula rilascia vescicole extracellulari (EV) di varie dimensioni che si traducono in molecole di segnalazione e inclusioni di membrana, che sono importanti per la comunicazione intercellulare¹. Anche le EV di diverse dimensioni svolgono ruoli biologici diversi, con 50-200 nm sEV in grado di distribuire con precisione RNA, DNA e proteine nella corretta posizione extracellulare. Il sEV aiuta anche a determinare i loro meccanismi di secrezione, coinvolgendo non solo la regolazione dei normali processi fisiologici come la sorveglianza immunitaria, il mantenimento delle cellule staminali, la coagulazione del sangue e la riparazione dei tessuti, ma anche la patologia alla base di diverse malattie come la progressione del tumore e le metastasi ^2,3. Un isolamento e un’analisi efficaci della sEV sono fondamentali per identificare i biomarcatori e progettare futuri interventi farmacologici.

Con la continua ricerca sull’applicazione clinica di sEV, i metodi di isolamento di sEV hanno avanzato requisiti più elevati. A causa dell’eterogeneità di sEV in termini di dimensioni, fonte e contenuto, nonché della loro somiglianza con altri EV nelle proprietà fisico-chimiche e biochimiche, non esiste un metodo standard per l’isolamento di sEV ^4,5. Attualmente, l’ultracentrifugazione, la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC), la precipitazione polimerica e la cattura per immunoaffinità sono i metodi di isolamento sEV più comuni⁶. L’ultracentrifugazione è ancora il gold standard per l’isolamento di sEV nella ricerca, nonostante richieda molto tempo, con conseguente bassa purezza con un’ampia distribuzione dimensionale di 40-500 nm e danni meccanici significativi al sEV dopo centrifugazione a lungo termine ^7,8,9. La precipitazione polimerica, che di solito utilizza glicole polietilenico (PEG), soffre di purezza inaccettabile per la successiva analisi funzionale con concomitante precipitazione di aggregati proteici extracellulari e contaminazione polimerica^10,11. I metodi basati sulla cattura dell’immunoaffinità richiedono anticorpi ad alto costo con specificità variabile, oltre ad avere problemi con bassi volumi di elaborazione e rese^12,13,14. La dimensione delle particelle è uno dei principali indicatori per valutare la purezza del sEV isolato. Sebbene la purezza di sEV rimanga un obiettivo irraggiungibile, SEC rimuove una notevole quantità di componenti medi e le particelle sEV estratte con il metodo SEC sono principalmente nell’intervallo 50-200 nm¹⁵. Le tecniche esistenti presentano alcuni svantaggi, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, la lunga durata, la bassa purezza, la bassa resa, la scarsa riproducibilità, la bassa produttività dei campioni e il potenziale danno della sEV, che la rende incompatibile con l’utilizzo clinico¹⁶. Pertanto, un metodo di isolamento sEV rapido, economico e dimensionale applicabile a diversi biofluidi è una necessità essenziale in diverse situazioni di ricerca e cliniche.

Nella citometria a flusso, le singole particelle vengono analizzate in modo multiparametrico ad alto rendimento e i sottoinsiemi vengono selezionati¹⁷. A causa dell’eterogeneità delle EV, sarebbe ideale una misurazione citometrica a flusso di particelle singole, che è stata utilizzata per studiare le EV seguendo i paradigmi dell’analisi cellulare, con etichette di dispersione della luce e fluorescenza utilizzate per identificare le caratteristiche correlate alla fisiologia e i componenti proteici^18,19,20. Tuttavia, la citometria a flusso convenzionale è messa alla prova dalle piccole dimensioni di sEV e dalla bassa abbondanza di biomarcatori di superficie. La sensibilità della citometria a flusso potrebbe essere migliorata ottimizzando i parametri di rilevamento per distinguere il rumore di fondo e il sEV indipendentemente dall’utilizzo di scatter in avanti (FSC), dispersione laterale (SSC) o parametro di attivazione della soglia di fluorescenza¹⁹.

Con il presente protocollo, le impostazioni di ordinamento citometrico a flusso ad alta risoluzione sono state ottimizzate utilizzando sfere fluorescenti come standard. Selezionando la dimensione corretta dell’ugello, la pressione del fluido della guaina, il parametro di attivazione della soglia e le tensioni che controllano le intensità della luce diffusa, siamo stati in grado di isolare un sottoinsieme specifico di sEV da una miscela complessa.

Protocol

1. Coltura cellulare Preparare un terreno di coltura di Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS). Coltura della cellula tumorale pancreatica umana, PANC-1, in un matraccio di coltura di 75 cm2 ad una densità di 1 x 106 cellule/ml. Incubare la coltura a 37 °C con il 5% di CO2. Subcoltura delle cellule quando la densità cellulare raggiunge il 75% -80% sotto osservazione microscopica. Rimuovere il mezzo e …

Representative Results

Il diagramma di flusso per il protocollo sperimentale è mostrato nella Figura 1. In questo metodo, sono state utilizzate microsfere di polistirene di dimensioni standard come standard di riferimento per la distribuzione granulometrica. Nella condizione del parametro strumentale specifico, il segnale delle particelle potrebbe essere chiaramente distinto dal rumore di fondo nel grafico FSC vs. SSC usando la forma logaritmica. Le strategie di gating sono illustrate nella F…

Discussion

Questo protocollo delinea un metodo ottimizzato per isolare e purificare sEV con la dimensione delle particelle specificata di 50-200 nm utilizzando un selezionatore di celle a flusso, che è stato convalidato da NTA. Il metodo ha risolto il problema del collo di bottiglia di ottenere sEV con dimensioni delle particelle uniformi e elevata purezza, evitando interferenze da molecole biologiche non correlate avvolte in EV di grandi dimensioni²². Analisi rapide e ad alto rendimento sono possibili con …

Materials

Centrifuge tube	Beckman Coulter	344058
Culture flasks	Corning	430641
Dulbecco’s modified eagle medium	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal bovine serum	SUER	SUER050QY
Flow cell sorter	Beckman Coulter	Moflo Astrios EQ
Human pancreatic cancer cell, PANC-1	NA	NA	PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University
Laser particle size and zeta potential analyzer	Malvern	Zetasizer Nano ZS 90
Phosphate buffer saline	Gibco	C20012500BT
Polystyrene fluorescent microspheres	Beckman Coulter	6602336
Transmission electron microscopy	JEOL	JEM-1200EX
Trypsin-EDTA solution	Gibco	1713949
Ultra rainbow fluorescent particles	Beckman Coulter	B28479
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima-L80XP
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW32TI