small extracellular vesicle의 High-throughput Isolation and Purification (고처리량 분리 및 정제를 위한 유세포 분석 분류 파라미터 최적화)
Summary
이 프로토콜은 공기 분무 노즐의 크기, 시스 유체 압력, 샘플 흐름 압력, 전압, 이득 및 트리거링 임계값 매개변수를 최적화하여 작은 세포외 소포에 대한 신속하고 크기별 분리 방법을 제공합니다.
Abstract
작은 세포외 소포(sEV)는 모든 세포 유형에서 방출될 수 있으며 단백질, DNA 및 RNA를 운반할 수 있습니다. 신호 분자는 세포의 생리적 및 병리학적 상태를 나타내는 지표 역할을 합니다. 그러나 다운스트림 바이오마커 식별 및 약물 개입 연구를 방해하는 sEV 분리를 위한 표준 방법은 없습니다. 이 기사에서는 플로우 셀 분류기에 의한 50-200nm sEV의 분리 및 정제를 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이를 위해 50μm 노즐과 80psi 시스 유체 압력을 선택하여 우수한 분류 속도와 안정적인 측류를 얻었습니다. 표준 크기의 폴리스티렌 미소 구체는 100, 200 및 300 nm 입자의 집단을 찾는 데 사용되었습니다. 전압, 이득 및 순방향 산란(FSC) 트리거 임계값을 추가로 최적화하면 sEV 신호를 배경 잡음과 분리할 수 있습니다. 이러한 최적화는 FSC 대 측면 산란(SSC)만 사용하여 sEV의 대표 모집단을 얻을 수 있는 중요한 정렬 설정 패널을 제공합니다. 유세포 분석 기반 분리 방법은 고처리량 분석을 가능하게 할 뿐만 아니라 바이오마커 발현을 기반으로 sEV의 동기식 분류 또는 프로테옴 분석을 가능하게 하여 수많은 다운스트림 연구 응용 분야를 열어줍니다.
Introduction
세포는 다양한 크기의 세포외 소포체(EV)를 방출하여 세포간 통신에 중요한 신호 분자와 막 내포물을 생성합니다1. 다양한 크기의 EV는 또한 50-200nm sEV가 RNA, DNA 및 단백질을 올바른 세포외 위치에 정확하게 분배할 수 있는 다양한 생물학적 역할을 합니다. sEV는 또한 면역 감시, 줄기 세포 유지, 혈액 응고 및 조직 복구와 같은 정상적인 생리적 과정의 조절뿐만 아니라 종양 진행 및 전이와 같은 여러 질병의 기저에 있는 병리를 포함하는 분비 메커니즘을 결정하는 데 도움이 됩니다 2,3. sEV의 효과적인 분리 및 분석은 바이오마커를 식별하고 향후 약물 개입을 설계하는 데 중요합니다.
sEV의 임상 적용에 대한 지속적인 연구로 sEV의 격리 방법은 더 높은 요구 사항을 제시했습니다. 크기, 출처 및 함량이 sEV의 이질성과 물리화학적 및 생화학적 특성에서 다른 EV와의 유사성으로 인해 sEV 분리를 위한 표준 방법이 없습니다 4,5. 현재, 초원심분리, 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 폴리머 침전, 면역친화성 포획이 가장 일반적인 sEV 분리 방법이다6. 초원심분리는 시간이 많이 소요됨에도 불구하고 연구에서 sEV 분리의 황금 표준으로 여전히 40-500nm의 넓은 크기 분포로 순도가 낮고 장기간 원심분리후 sEV에 상당한 기계적 손상을 입힙니다 7,8,9. 일반적으로 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 사용하는 고분자 침전은 세포 외 단백질 응집체 및 고분자 오염의 수반되는 침전과 함께 후속 기능 분석에 대해 허용 할 수없는 순도로 어려움을 겪습니다10,11. 면역친화성 포획 기반 방법은 다양한 특이성을 갖는 고가의 항체를 필요로 할 뿐만 아니라 낮은 처리 부피 및 수율12,13,14에 문제가 있습니다. 입자 크기는 분리된 sEV의 순도를 평가하는 주요 지표 중 하나입니다. sEV 순도는 달성할 수 없는 목표로 남아 있지만 SEC는 상당한 양의 중간 성분을 제거하며 SEC 방법으로 추출된 sEV 입자는 주로 50-200nm범위에 있습니다 15. 기존 기술은 시간 소모적이고, 순도가 낮고, 수율이 낮고, 재현성이 낮고, 시료 처리량이 낮고, sEV의 잠재적 손상이 있어 임상적 활용과 양립할 수 없는 몇 가지 단점이 있다16. 따라서 다양한 생체 유체에 적용할 수 있는 빠르고 저렴하며 크기가 지정된 sEV 분리 방법은 여러 연구 및 임상 상황에서 필수적인 요구 사항입니다.
유세포 분석에서, 단일 입자는 높은 처리량, 다중모수 방식으로 분석되고, 부분집합은 분류된다17. EV의 이질성으로 인해, 단일 입자 유세포 측정이 이상적일 것이며, 이는 세포 분석의 패러다임에 따라 EV를 조사하는 데 사용되어 왔으며, 광 산란 및 형광 표지는 생리학 관련 특징 및 단백질 성분을 식별하는 데 사용됩니다18,19,20. 그럼에도 불구하고 기존의 유세포 분석은 sEV의 크기가 작고 표면 바이오마커가 적기 때문에 어려움을 겪고 있습니다. 유세포 분석의 감도는 전방 산란(FSC), 측면 산란(SSC) 또는 형광 임계값 트리거 파라미터19를 사용하는 것과 관계없이 배경 잡음과 sEV를 구별하기 위해 검출 파라미터를 최적화함으로써 향상될 수 있습니다.
현재 프로토콜에서는 형광 비드를 표준으로 사용하여 고분해능 유세포 분석 정렬 설정을 최적화했습니다. 적절한 노즐 크기, 피복액 압력, 임계값 트리거링 매개변수 및 산란광 강도를 제어하는 전압을 선택하여 복잡한 혼합물에서 sEV의 특정 하위 집합을 분리할 수 있었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 NTA에서 검증한 플로우 셀 분류기를 사용하여 지정된 입자 크기 50-200nm로 sEV를 분리하고 정제하는 최적화된 방법을 설명합니다. 이 방법은 균일한 입자 크기와 고순도의 sEV를 얻는 병목 문제를 해결하여 대형 EV에 싸인 관련 없는 생물학적 분자의 간섭을 피했습니다(22). 초당 100,000개의 입자를 포획하고 초당 70,000개의 분류 결정을 내릴 수 있는 유세포 분석을 통해 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 절강 중의과 대학 과학 연구 기금 (2020ZG29), 절강 성 기본 공공 복지 연구 프로젝트 (LGF19H150006, LTGY23B070001), 절강 성 교육부 프로젝트 (Y202147028) 및 절강 대학 실험실 부서의 실험 기술 프로젝트 (SJS201712, SYB202130).
Materials
| Centrifuge tube | Beckman Coulter | 344058 | |
| Culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s modified eagle medium | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | SUER | SUER050QY | |
| Flow cell sorter | Beckman Coulter | Moflo Astrios EQ | |
| Human pancreatic cancer cell, PANC-1 | NA | NA | PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University |
| Laser particle size and zeta potential analyzer | Malvern | Zetasizer Nano ZS 90 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco | C20012500BT | |
| Polystyrene fluorescent microspheres | Beckman Coulter | 6602336 | |
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-1200EX | |
| Trypsin-EDTA solution | Gibco | 1713949 | |
| Ultra rainbow fluorescent particles | Beckman Coulter | B28479 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima-L80XP | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW32TI |
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