Optimering av flödescytometriska sorteringsparametrar för isolering med hög genomströmning och rening av små extracellulära vesiklar

Summary

Detta protokoll tillhandahåller en snabb och storleksspecifik isoleringsmetod för små extracellulära vesiklar genom att optimera storleken på luftsprutmunstycket, mantelvätsketrycket, provflödestrycket, spänningen, förstärkningen och utlösande tröskelparametrarna.

Abstract

Små extracellulära vesiklar (sEV) kan frisättas från alla celltyper och bära protein, DNA och RNA. Signalmolekyler tjänar som indikatorer på cellens fysiologiska och patologiska tillstånd. Det finns dock ingen standardmetod för sEV-isolering, vilket förhindrar nedströms biomarköridentifiering och läkemedelsinterventionsstudier. I den här artikeln tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för isolering och rening av 50-200 nm sEV av en flödescellsorterare. För detta valdes ett 50 μm munstycke och 80 psi mantelvätsketryck för att få en bra sorteringshastighet och stabil sidoström. Standardstora polystyrenmikrosfärer användes för att lokalisera populationer av 100, 200 och 300 nm partiklar. Med ytterligare optimering av utlösningströskeln för spänning, förstärkning och framåtspridning (FSC) kan sEV-signalen separeras från bakgrundsbruset. Dessa optimeringar ger en panel med kritiska sorteringsinställningar som gör att man kan få en representativ population av sEV med endast FSC kontra sidospridning (SSC). Den flödescytometribaserade isoleringsmetoden möjliggör inte bara analys med hög genomströmning utan möjliggör också synkron klassificering eller proteomanalys av sEV baserat på biomarköruttrycket, vilket öppnar många forskningsapplikationer nedströms.

Introduction

En cell släpper ut extracellulära vesiklar (EV) av varierande storlek som resulterar i signalmolekyler och membraninneslutningar, vilket är viktigt för intercellulär kommunikation¹. EV i olika storlekar spelar också olika biologiska roller, med 50-200 nm sEV som exakt kan distribuera RNA, DNA och proteiner till rätt extracellulär plats. EV hjälper också till att bestämma deras utsöndringsmekanismer, som inte bara involverar reglering av normala fysiologiska processer som immunövervakning, stamcellsunderhåll, blodkoagulation och vävnadsreparation utan också patologin bakom flera sjukdomar som tumörprogression och metastasering ^2,3. Effektiv isolering och analys av sEV är avgörande för att identifiera biomarkörer och utforma framtida läkemedelsinterventioner.

Med kontinuerlig forskning om den kliniska tillämpningen av sEV har isoleringsmetoderna för sEV ställt högre krav. På grund av heterogeniteten hos sEV i storlek, källa och innehåll, liksom deras likhet med andra EV i fysikalisk-kemiska och biokemiska egenskaper, finns det ingen standardmetod för sEV-isolering ^4,5. För närvarande är ultracentrifugering, storleksuteslutningskromatografi (SEC), polymerutfällning och immunoaffinitetsinfångning de vanligaste sEV-isoleringsmetoderna⁶. Ultracentrifugering är fortfarande guldstandarden för sEV-isolering inom forskning, trots att den är tidskrävande, vilket resulterar i låg renhet med en bred storleksfördelning på 40-500 nm och betydande mekaniska skador på sEV efter långvarig centrifugering ^7,8,9. Polymerutfällning, som vanligtvis använder polyetylenglykol (PEG), lider av oacceptabel renhet för efterföljande funktionell analys med samtidig utfällning av extracellulära proteinaggregat och polymerkontaminering^10,11. Immunoaffinitetsinfångningsbaserade metoder kräver högkostnadsantikroppar med varierande specificitet, samt har problem med låg bearbetningsvolym och ger^12,13,14. Partikelstorlek är en av huvudindikatorerna för att utvärdera renheten hos isolerad sEV. Även om sEV-renhet fortfarande är ett ouppnåeligt mål, tar SEC bort en betydande mängd medelkomponenter, och sEV-partiklarna extraherade med SEC-metoden ligger huvudsakligen i intervallet 50-200 nm¹⁵. De befintliga teknikerna har några nackdelar, inklusive men inte begränsat till att vara tidskrävande, låg renhet, lågt utbyte, dålig reproducerbarhet, låg genomströmning av prover och potentiell skada på sEV, vilket gör den oförenlig med klinisk användning¹⁶. Således är en snabb, billig och storleksspecificerad sEV-isoleringsmetod som är tillämplig på olika biofluider ett väsentligt behov i flera forsknings- och kliniska situationer.

I flödescytometri analyseras enskilda partiklar på ett multiparametriskt sätt med hög genomströmning och delmängder sorteras ut¹⁷. På grund av EV: s heterogenitet skulle en cytometrisk mätning av partikelflöde vara idealisk, som har använts för att undersöka EV efter paradigmerna för cellanalys, med ljusspridnings- och fluorescensetiketter som används för att identifiera fysiologirelaterade egenskaper och proteinkomponenter^18,19,20. Ändå utmanas konventionell flödescytometri av den lilla storleken på sEV och låg överflöd av ytbiomarkörer. Flödescytometrins känslighet kan förbättras genom att optimera detektionsparametrar för att skilja bakgrundsbrus och sEV oavsett om man använder framåtspridning (FSC), sidospridning (SSC) eller fluorescenströskel som utlöser parameter¹⁹.

Med det nuvarande protokollet optimerades högupplösta flödescytometriska sorteringsinställningar med fluorescerande pärlor som standard. Genom att välja rätt munstycksstorlek, mantelvätsketryck, tröskelutlösningsparameter och spänningar som styr spridda ljusintensiteter kunde vi isolera en specifik delmängd av sEV från en komplex blandning.

Protocol

1. Cellodling Förbered ett odlingsmedium av Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS). Odla den humana bukspottkörtelcancercellen, PANC-1, i en 75 cm2 odlingskolv med en densitet av 1 x 106 celler/ml. Inkubera kulturen vid 37 °C med 5 %CO2. Subkultur cellerna när celldensiteten når 75% -80% under mikroskopisk observation. Ta bort mediet och skölj 2x med 3-5 ml fosfatbuffertsaltlösning (PBS; 0,01 M, pH…

Representative Results

Flödesschemadiagrammet för experimentprotokollet visas i figur 1. I denna metod användes standardstora polystyrenmikrosfärer som referensstandarder för partikelstorleksfördelning. Under det specifika instrumentella parametervillkoret kunde partikelsignalen tydligt särskiljas från bakgrundsbruset i FSC vs. SSC-diagrammet med hjälp av den logaritmiska formen. Gating strategier visas i figur 2. R4, R5 och R6 hänvisar till positionerna för 100 nm, 200 nm …

Discussion

Detta protokoll beskriver en optimerad metod för att isolera och rena sEV med den angivna partikelstorleken 50-200 nm med hjälp av en flödescellsorterare, som validerades av NTA. Metoden löste flaskhalsproblemet med att erhålla sEV med enhetlig partikelstorlek och hög renhet, vilket undviker störningar från obesläktade biologiska molekyler inslagna i stora EV²². Snabba analyser med hög genomströmning är möjliga med flödescytometri, som kan fånga 100 000 partiklar per sekund och fatt…

Materials

Centrifuge tube	Beckman Coulter	344058
Culture flasks	Corning	430641
Dulbecco’s modified eagle medium	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal bovine serum	SUER	SUER050QY
Flow cell sorter	Beckman Coulter	Moflo Astrios EQ
Human pancreatic cancer cell, PANC-1	NA	NA	PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University
Laser particle size and zeta potential analyzer	Malvern	Zetasizer Nano ZS 90
Phosphate buffer saline	Gibco	C20012500BT
Polystyrene fluorescent microspheres	Beckman Coulter	6602336
Transmission electron microscopy	JEOL	JEM-1200EX
Trypsin-EDTA solution	Gibco	1713949
Ultra rainbow fluorescent particles	Beckman Coulter	B28479
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima-L80XP
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW32TI