Detección de cardiotoxicidad de alto rendimiento utilizando monocapas maduras de cardiomiocitos derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos
Summary
Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) ofrecen una alternativa al uso de animales para la detección preclínica de cardiotoxicidad. Una limitación para la adopción generalizada de hiPSC-CM en la detección de toxicidad preclínica es el fenotipo inmaduro de las células. Aquí se presentan protocolos para la maduración robusta y rápida de hiPSC-CM.
Abstract
Los cardiomiocitos derivados de células madre inducidas humanas (hiPSC-CM) se utilizan para reemplazar y reducir la dependencia de animales y células animales para pruebas preclínicas de cardiotoxicidad. En formatos monocapa bidimensionales, los hiPSC-CM recapitulan la estructura y función de las células del músculo cardíaco humano adulto cuando se cultivan en una matriz extracelular óptima (ECM). Una ECM (matriz extracelular inductora de maduración-MECM) derivada de células madre perinatales humanas madura la estructura, función y estado metabólico de hiPSC-CM en 7 días después de la placa.
Las monocapas maduras de hiPSC-CM también responden como se espera a los medicamentos clínicamente relevantes, con un riesgo conocido de causar arritmias y cardiotoxicidad. La maduración de las monocapas hiPSC-CM fue un obstáculo para la adopción generalizada de estas valiosas células para la ciencia regulatoria y la detección de seguridad, hasta ahora. Este artículo presenta métodos validados para el recubrimiento, la maduración y el fenotipado funcional de alto rendimiento de la función electrofisiológica y contráctil de hiPSC-CM. Estos métodos se aplican a los cardiomiocitos purificados disponibles comercialmente, así como a los cardiomiocitos derivados de células madre generados internamente utilizando protocolos de diferenciación altamente eficientes y específicos de la cámara.
La función electrofisiológica de alto rendimiento se mide utilizando colorantes sensibles al voltaje (VSD; emisión: 488 nm), fluoróforos sensibles al calcio (CSF) o sensores de calcio codificados genéticamente (GCaMP6). Se utiliza un dispositivo de mapeo óptico de alto rendimiento para las grabaciones ópticas de cada parámetro funcional, y se utiliza un software dedicado personalizado para el análisis de datos electrofisiológicos. Los protocolos MECM se aplican para la detección de medicamentos utilizando un inotrópico positivo (isoprenalina) y bloqueadores específicos del canal del gen humano relacionado con Ether-a-go-go (hERG). Estos recursos permitirán a otros investigadores utilizar con éxito hiPSC-CM maduros para la detección de cardiotoxicidad preclínica de alto rendimiento, pruebas de eficacia de medicamentos cardíacos e investigación cardiovascular.
Introduction
Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) han sido validados a escala internacional y están disponibles para el cribado de cardiotoxicidad in vitro 1. Los hiPSC-CM de alta pureza pueden generarse en cantidades prácticamente ilimitadas, criopreservarse y descongelarse. Al rechapar, también se reaniman y comienzan a contraerse con un ritmo que recuerda al corazón humano 2,3. Sorprendentemente, los hiPSC-CM individuales se acoplan entre sí y forman una sincitia funcional que late como un solo tejido. Hoy en día, las hiPSCs se derivan rutinariamente de muestras de sangre de pacientes, por lo que cualquier persona puede ser representada utilizando ensayos de detección de cardiotoxicidad hiPSC-CM in vitro 4,5. Esto crea la oportunidad de realizar “Ensayos Clínicos en un Plato”, con representación significativa de diversas poblaciones6.
Una ventaja crítica sobre los enfoques existentes de detección de cardiotoxicidad de células animales y animales es que los hiPSC-CM utilizan el genoma humano completo y ofrecen un sistema in vitro con similitudes genéticas con el corazón humano. Esto es especialmente atractivo para la farmacogenómica y la medicina personalizada: se prevé que el uso de hiPSC-CM para el desarrollo de medicamentos y otras terapias proporcionará prescripciones de medicamentos más precisas, precisas y seguras. De hecho, los ensayos bidimensionales (2D) de monocapa hiPSC-CM han demostrado ser predictivos de cardiotoxicidad de medicamentos, utilizando un panel de medicamentos clínicamente utilizados con un riesgo conocido de causar arritmias 1,7,8,9. A pesar del vasto potencial de los hiPSC-CM y la promesa de racionalizar y abaratar el desarrollo de fármacos, ha habido una renuencia a utilizar estos nuevos ensayos10,11,12.
Hasta ahora, una limitación importante de la adopción y aceptación generalizadas de los ensayos de detección de hiPSC-CM es su apariencia inmadura, similar a la fetal, así como su función. El tema crítico de la maduración de hiPSC-CM ha sido revisado y debatido en la literatura científica hasta la saciedad13,14,15,16. Del mismo modo, se han empleado muchos enfoques para promover la maduración de hiPSC-CM, incluyendo manipulaciones de matriz extracelular (ECM) en monocapas 2D y el desarrollo de tejidos cardíacos diseñados en 3D (EHT)17,18. Por el momento, existe la creencia generalizada de que el uso de EHT 3D proporcionará una maduración superior en relación con los enfoques basados en monocapa 2D. Sin embargo, las monocapas 2D proporcionan una mayor eficiencia de utilización celular y un mayor éxito en el recubrimiento en comparación con los EHT 3D; Los EHT 3D utilizan un mayor número de células y, a menudo, requieren la inclusión de otros tipos de células que pueden confundir los resultados. Por lo tanto, en este artículo, la atención se centra en el uso de un método simple para madurar hiPSC-CM cultivados como monocapas 2D de células acopladas eléctrica y mecánicamente.
La maduración avanzada de hiPSC-CM se puede lograr en monocapas 2D utilizando un ECM. Las monocapas 2D de hiPSC-CM pueden madurarse utilizando un cubreobjetos de polidimetilsiloxano suave y flexible, recubierto con una matriz de membrana basal secretada por una célula de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (ECM de ratón). En 2016, los informes mostraron que los hiPSC-CM cultivados en esta condición de ECM blanda maduraron funcionalmente, mostrando velocidades de conducción potenciales de acción cercanas a los valores cardíacos adultos (~ 50 cm / s)18. Además, estos hiPSC-CM maduros mostraron muchas otras características electrofisiológicas que recuerdan al corazón adulto, incluido el potencial de membrana en reposo hiperpolarizado y la expresión de Kir2.1. Más recientemente, los informes identificaron un recubrimiento ECM derivado de células madre perinatales humanas que promueve la maduración estructural de 2D hiPSC-CMs19. Aquí, se presentan métodos fáciles de usar para monocapas 2D hiPSC-CM estructuralmente maduras para su uso en pantallas electrofisiológicas de alto rendimiento. Además, proporcionamos validación de un instrumento de mapeo óptico para la adquisición y análisis automatizados de la función electrofisiológica monocapa 2D hiPSC-CM, utilizando colorantes sensibles al voltaje (VSD) y sondas y proteínas sensibles al calcio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existen varios enfoques diferentes para la detección de cardiotoxicidad in vitro utilizando hiPSC-CM. Un reciente documento de “Mejores prácticas” sobre el uso de hiPSC-CM presentó los diversos ensayos in vitro , sus lecturas primarias y, lo que es más importante, la granularidad de cada ensayo para cuantificar la función electrofisiológica cardíaca humana20. Además de usar electrodos perforadores de membrana, la medida más directa de la función electrofisiológica card…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo ha sido apoyado por las subvenciones de los NIH HL148068-04 y R44ES027703-02 (TJH).
Materials
| 0.25% Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L) | Millipore Sigma | A3294 | |
| 2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L) | Millipore Sigma | H4034 | |
| AdGCaMP6m | Vector biolabs | 1909 | |
| Albumin human | Sigma | A9731-1G | |
| alpha actinin antibody | ThermoFisher | MA1-22863 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Blebbistatin | Sigma | B0560 | |
| CalBryte 520AM | AAT Bioquest | 20650 | |
| CELLvo MatrixPlus 96wp | StemBiosys | N/A | https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus |
| CHIR99021 | LC Laboratories | c-6556 | |
| Clear Assay medium (fluorobrite) | ThermoFisher | A1896701 | For adenovirus transduction |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135-500ML | |
| FluoVolt | ThermoFisher | F10488 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| iCell CM maintenance media | FUJIFILM/Cellular Dynamics | M1003 | |
| iCell2 CMs | FUJIFILM | 1434 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | ||
| iPS DF19-9-11T.H | WiCell | ||
| Isoproterenol | MilliporeSigma | CAS-51-30-9 | |
| IWP4 | Tocris | 5214 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960-5g | |
| L-glutamine | Gibco | A2916801 | |
| LS columns | Miltenyii Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Buffer (autoMACS Running Buffer) | Miltenyii Biotec | 130-091-221 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| MitoTracker Red | ThermoFisher | M7512 | |
| Nautilus HTS Optical Mapping | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Nikon A1R Confocal Microscope | Nikon | ||
| nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| pre-separation filter | Miltenyii Biotec | 130-041-407 | |
| PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, human | Miltenyii Biotec | 130-110-188 | |
| Pulse | CuriBio | https://www.curibio.com/products-overview | |
| Quadro MACS separator (Magnet) | Miltenyii Biotec | 130-091-051 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine) | Gibco | 22400-089 | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyii Biotec | 130-107-086 | |
| TnI antibody (pan TnI) | Millipore Sigma | MAB1691 | |
| Versene (ethylenediaminetetraacetic acid – EDTA solution) | Gibco | 15040-066 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
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