플루오로겐 RNA 압타머에 대한 시험관 내 및 세포 턴온 역학 결정
Summary
이 프로토콜은 플루오로 생성 RNA 압타머 시금치2 및 브로콜리의 동역학을 결정하는 두 가지 방법을 제시합니다. 첫 번째 방법은 플레이트 리더로 시험관 내에서 형광 발생 압타머 역학을 측정하는 방법을 설명하는 반면, 두 번째 방법은 유세포 분석에 의한 세포의 형광 발생 압타머 역학 측정을 자세히 설명합니다.
Abstract
플루오로제닉 RNA 앱타머는 살아있는 세포에 적용되어 RNA에 태그 및 시각화하고, 유전자 발현에 대해 보고하고, 대사 산물 및 신호 분자의 수준을 감지하는 형광 바이오센서를 활성화합니다. 이들 시스템 각각에서의 동적 변화를 연구하기 위해서는, 실시간 측정을 얻는 것이 바람직하지만, 측정의 정확도는 샘플링 주파수보다 빠른 형광 생성 반응의 동역학에 의존한다. 여기에서는 각각 샘플 주입기와 유세포분석기가 장착된 플레이트 리더를 사용하여 플루오로제닉 RNA 앱타머에 대한 시험관내 및 세포 턴온 동역학을 결정하는 방법을 설명합니다. 우리는 시금치2 및 브로콜리 압타머의 형광 활성화에 대한 시험관 내 동역학이 2상 연관 반응으로 모델링될 수 있고 각각 0.56 s-1 및 0.35 s-1의 다른 빠른 위상 속도 상수를 갖는다는 것을 보여줍니다. 또한, 우리는 그람 음성 박테리아로의 염료 확산에 의해 더욱 제한되는 대장균에서 시금치2의 형광 활성화를 위한 세포 역학이 분 시간 척도에서 정확한 샘플링 빈도를 가능하게 할 만큼 충분히 빠르다는 것을 보여줍니다. 형광 활성화 동역학을 분석하기 위한 이러한 방법은 개발된 다른 형광 RNA 앱타머에 적용할 수 있습니다.
Introduction
형광 생성 반응은 형광 신호를 생성하는 화학 반응입니다. 플루오로제닉 RNA 앱타머는 일반적으로 형광 양자 수율을 향상시키기 위해 소분자 염료를 결합하여 이 기능을 수행합니다(그림 1A)1. 상이한 플루오로겐 RNA 앱타머 시스템이 개발되었고, 특정 RNA 앱타머 서열 및 상응하는 염료 리간드1로 구성된다. 플루오로 제닉 RNA 앱타머는 mRNA 및 비 코딩 RNA 2,3,4의 라이브 셀 이미징을 가능하게하는 형광 태그로 RNA 전사체에 추가되었습니다. 그들은 또한 보고 기능이 RNA 수준 5,6이라는 점을 제외하고는 녹색 형광 단백질(GFP)을 리포터로 사용하는 것과 유사하게 유전자 발현의 형광 리포터로서 프로모터 서열 뒤에 배치되었습니다. 마지막으로, 플루오로 생성 RNA 압타머는 특정 소분자에 반응하여 형광 생성 반응을 유발하도록 설계된 RNA 기반 형광 바이오 센서에 통합되었습니다. RNA 기반 형광 바이오센서는 다양한 비형광 대사산물 및 신호 분자 7,8,9,10,11의 라이브 셀 이미징을 위해 개발되었습니다.
RNA 국소화, 유전자 발현 및 소분자 신호의 동적 변화를 시각화하기 위한 형광 RNA 압타머의 개발에 대한 관심이 높아지고 있습니다. 이러한 각 응용 분야에 대해 실시간 측정을 얻는 것이 바람직하지만 측정의 정확도는 샘플링 주파수보다 빠른 형광 발생 반응의 역학에 따라 달라집니다. 여기에서는 샘플 주입기가 장착된 플레이트 리더를 사용하여 형광 RNA 앱타머 시금치212 및 브로콜리13에 대한 시험관 내 동역학을 결정하고 유세포분석기를 사용하여 대장균에서 발현되는 시금치2에 대한 세포 턴온 동역학을 결정하는 방법을 설명합니다. 이 두 RNA 앱타머는 RNA 국소화연구 2,3,4에 적용되었기 때문에 선택되었으며, 리포터 5,6 및 바이오센서 7,8,9,10,11에 사용되었으며, 해당 염료 리간드(DFHBI 또는 DFHBI-1T)가 시판되고 있습니다. 문헌에서 결정된 이들의 시험관내 특성의 요약은 표 1 4,13,14에 주어지며, 이는 프로토콜 개발(예를 들어, 사용된 파장 및 염료 농도)을 알렸다. 이러한 결과는 RNA 앱타머에 의해 영향을 받는 형광 생성 반응이 빠르며 원하는 세포 생물학적 응용을 위한 정확한 측정을 방해해서는 안 된다는 것을 보여줍니다.
Protocol
1. 체외 동역학 실험 PCR에 의한 DNA 주형의 제조PCR 반응 설정: PCR 반응을 준비하려면 얇은 벽의 PCR 튜브에 다음 시약을 결합하십시오.33 μL의 이중 증류수 (ddH2O)고충실도 DNA 중합효소를 위한 10μL의 5x 버퍼5 μL의 2 mM 각각 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP)0.5 μL의 40 μM 정방향 프라이머0.5μL의 40μM 리버스 프라이머0.5 μL (10-100 ng)?…
Representative Results
체외 동역학합성 올리고뉴클레오티드로 구입한 DNA 주형 및 프라이머의 서열은 표 2 에 나와 있으며 시약 레시피는 보충 파일 1에 나와 있습니다. PCR 증폭은 후속 시험관 전사 (IVT) 반응에 필요한 T7 프로모터로 DNA 주형의 양을 확장하는 데 사용됩니다. 또한, PCR 증폭은 동일한 반응에서 두 가지 목적으로 사용될 수 있습니다: 프라이…
Discussion
시험관내 동역학 실험을 위해, 동일한 일반 프로토콜이 리간드-결합 및 형광단-결합 도메인8 둘 다를 함유하는 RNA-기반 형광 바이오센서의 시험관내 동역학을 측정하도록 변형될 수 있다. 이 경우, RNA는 리간드 반응 동역학을 얻기 위해 리간드 주입시 측정 전에 형광단과 함께 배양되어야 한다. 반복실험 간에 높은 변동성이 관찰되면 측정 전에 각 샘플이 96웰 플레?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 MCH에 대한 NSF-BSF 1815508 및 NIH R01 GM124589에 대한 보조금으로 지원되었습니다. MRM은 훈련 보조금 NIH T32 GM122740에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Agarose | Thermo Fischer Scientific | BP160500 | |
| Agarose gel electrophoresis equipment | Thermo Fischer Scientific | B1A-BP | |
| Alpha D-(+)-lactose monohydrate | Thermo Fischer Scientific | 18-600-440 | |
| Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | 22431021 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| Attune NxT Flow cytometer | Thermo Fischer Scientific | A24861 | |
| Attune 1x Focusing Fluid | Thermo Fischer Scientific | A24904 | |
| Attune Shutdown Solution | Thermo Fischer Scientific | A24975 | |
| Attune Performance Tracking Beads | Thermo Fischer Scientific | 4449754 | |
| Attune Wash Solution | Thermo Fischer Scientific | J24974 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C3416 | |
| Chlorine Bleach | Amazon | B07J6FJR8D | |
| Corning Costar 96-well plate | Daigger Scientific | EF86610A | |
| Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap | Globe Scientific | 05-402-31 | |
| DFHBI | Sigma-Aldrich | SML1627 | |
| DFHBI-1T | Sigma-Aldrich | SML2697 | |
| D-Glucose (anhydrous) | Acros Organics | AC410955000 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| DNA loading dye | New England Biolabs | B7025S | |
| DNA LoBind Tubes (2.0 mL) | Eppendorf | 22431048 | |
| dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP | New England Biolabs | N0446S | |
| EDTA, pH 8.0 | Gibco, Life Technologies | AM9260G | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Filter-tip micropipettor tips | Thermo Fischer Scientific | AM12635, AM12648, AM12655, AM12665 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | N/A | FlowJo v10 Software |
| Fluorescent plate reader with heating control | VWR | 10014-924 | |
| Gel electrophoresis power supply | Thermo Fischer Scientific | EC3000XL2 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycogen AM95010 | Thermo Fischer Scientific | AM95010 | |
| GraphPad Prism | Dotmatics | N/A | Analysis software from Academic Group License |
| Heat block | Thomas Scientific | 1159Z11 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma-Aldrich | I1643-500UN | |
| Low Molecular Weight DNA Ladder | New England Biolabs | N3233L | Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025). |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher Scientific | MFCD00011110 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
| Microcentrifuge with temperature control | Marshall Scientific | EP-5415R | |
| Micropipettors | Gilson | FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M | |
| Micropipettor tips | Sigma-Aldrich | Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR | |
| Millipore water filter with BioPak unit | Sigma-Aldrich | CDUFBI001, ZRQSVR3WW | |
| Narrow micropipettor pipette tips | DOT Scientific | RN005R-LRS | |
| PBS, 10x | Thermo Fischer Scientific | BP39920 | |
| PCR clean-up kit | Qiagen | 28181 | |
| PCR primers and templates | Integrated DNA technologies | ||
| PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes | Bio-Rad | 1851148 | |
| PCR thermocycler for 0.5 mL tubes | Techne | 5PRIME/C | |
| pET31b-T7-Spinach2 Plasmid | Addgene | Plasmid #79783 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530L | Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions. |
| Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific | C.B.S. Scientific | VGC-1508 | |
| Polyacrylamide gel electrophoresis equipment | C.B.S. Scientific | ASG-250 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Razor blades | Genesee Scientific | 38-101 | |
| rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP | New England Biolabs | N0450L | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Short wave UV light source | Thermo Fischer Scientific | 11758221 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Thermo Fischer Scientific | S375-500 | |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License |
| Sterile filter units | Thermo Fischer Scientific | 09-741-88 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Thermo Fischer Scientific | S33102 | |
| TAE buffer for agarose gel electrophoresis | Thermo Fischer Scientific | AM9869 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Tryptone (granulated) | Thermo Fischer Scientific | M0251S | |
| T7 RNA polymerase | New England Biolabs | M0251S | |
| Urea-PAGE Gel system | National Diagnostics | EC-833 | |
| UV fluorescent TLC plate | Sigma-Aldrich | 1.05789.0001 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-8000-GL | |
| Vortex mixer | Thermo Fischer Scientific | 2215415 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| Yeast Extract (Granulated) | Thermo Fischer Scientific | BP9727-2 |
References
- Su, Y., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs. Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).
- Zhang, J., et al. Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells. Scientific Reports. 5, 17295 (2015).
- Wang, Z., et al. In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time. Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).
- Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA. Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).
- Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).
- Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).
- Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).
- Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP. Nucleic Acids Research. 44 (17), 139 (2016).
- Paige, J. S., Thinh, N. -. D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA. Science. 335 (6073), 1194 (2012).
- Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
- Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
- Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach. Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).
- Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).
- Basch, H., Gadebusch, H. H. In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide. Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).
- Kallansrud, G., Ward, B. A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients. Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).
- Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs. RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).
- Szatmári, D., et al. Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies. Scientific Reports. 10, 12002 (2020).
- Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD® BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
- Huang, H., et al. A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore. Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).
- Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers. RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).
- Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging. Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).
- Wang, P., et al. Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging. Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).
- Dao, N. T., et al. Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach. Scientific Reports. 11, 7356 (2021).
Citer Cet Article
Mumbleau, M. M., Meyer, M. R., Hammond, M. C. Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers. J. Vis. Exp. (186), e64367, doi:10.3791/64367 (2022).