Détermination de la cinétique d’activation in vitro et cellulaire pour les aptamères d’ARN fluorogéniques

Summary

Le protocole présente deux méthodes pour déterminer la cinétique des aptamères d’ARN fluorogéniques Spinach2 et Brocoli. La première méthode décrit comment mesurer la cinétique des aptamères fluorogéniques in vitro avec un lecteur de plaques, tandis que la deuxième méthode détaille la mesure de la cinétique des aptamères fluorogéniques dans les cellules par cytométrie en flux.

Abstract

Des aptamères d’ARN fluorogéniques ont été appliqués dans des cellules vivantes pour marquer et visualiser les ARN, rendre compte de l’expression des gènes et activer des biocapteurs fluorescents qui détectent les niveaux de métabolites et de molécules de signalisation. Afin d’étudier les changements dynamiques dans chacun de ces systèmes, il est souhaitable d’obtenir des mesures en temps réel, mais la précision des mesures dépend de la cinétique de la réaction fluorogénique plus rapide que la fréquence d’échantillonnage. Ici, nous décrivons des méthodes pour déterminer la cinétique d’activation in vitro et cellulaire pour les aptamères d’ARN fluorogénique à l’aide d’un lecteur de plaques équipé respectivement d’un injecteur d’échantillon et d’un cytomètre en flux. Nous montrons que la cinétique in vitro pour l’activation de fluorescence des aptamères Spinach2 et Brocoli peut être modélisée comme des réactions d’association à deux phases et ont différentes constantes de vitesse de phase rapide de 0,56 s-1 et 0,35 ^s-1, respectivement. De plus, nous montrons que la cinétique cellulaire pour l’activation de fluorescence des épinards2 chez Escherichia coli, qui est encore limitée par la diffusion du colorant dans les bactéries à Gram négatif, est encore suffisamment rapide pour permettre une fréquence d’échantillonnage précise sur l’échelle de temps infime. Ces méthodes d’analyse de la cinétique d’activation de fluorescence sont applicables à d’autres aptamères d’ARN fluorogéniques qui ont été développés.

Introduction

Les réactions fluorogéniques sont des réactions chimiques qui génèrent un signal de fluorescence. Les aptamères d’ARN fluorogénique remplissent généralement cette fonction en liant un colorant à petite molécule pour améliorer son rendement quantique de fluorescence (Figure 1A)¹. Différents systèmes d’aptamères d’ARN fluorogéniques ont été développés et se composent de séquences d’aptamères d’ARN spécifiques et des ligands colorants correspondants¹. Des aptamères d’ARN fluorogéniques ont été ajoutés aux transcrits d’ARN sous forme de marqueurs fluorescents qui permettent l’imagerie de cellule....

Protocol

1. Expérience de cinétique in vitro

1. Préparation de modèles d’ADN par PCR
   1. Configurer la ou les réactions PCR : Pour préparer les réactions PCR, combinez les réactifs suivants dans un tube PCR à paroi mince :
      33 μL d’eau bidistillée (_ddH2O)
      10 μL de tampon 5x pour ADN polymérase haute fidélité
      5 μL de 2 mM de désoxyribonucléoside triphosphate (dNTP)
      0,5 μL d’amorce avant de 40 μM
      0,5 μL d’amorce inverse 40 μM
      0,5 μL (10-100 ng) de matrice d’ADN (pour la PCR Spinach2 seulement; Les apprêts pour le brocoli se chevauchent)
      0,5 μL d’ADN polymérase haute fidélité (ajouter en dernier)
      REMARQUE: Les ....

Results

Cinétique in vitro
Les séquences des matrices et des amorces d’ADN, qui sont achetées comme oligonucléotides synthétiques, sont présentées dans le tableau 2, et les recettes de réactifs sont présentées dans le fichier supplémentaire 1. L’amplification par PCR est utilisée pour augmenter la quantité de matrice d’ADN avec le promoteur T7, ce qui est nécessaire pour la réaction ultérieure de transcription in vitro (IVT). En outre, l’am.......

Discussion

Pour l’expérience de cinétique in vitro, le même protocole général peut être modifié pour mesurer la cinétique in vitro d’un biocapteur fluorescent à base d’ARN contenant à la fois un domaine de liaison au ligand et un domaine de liaison au fluorophore 8. Dans ce cas, l’ARN doit être incubé avec le fluorophore avant les mesures lors de l’injection du ligand afin d’obtenir la cinétique de réponse du ligand. Si une grande variabilité est observée entre les répétitions, on peut réso.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
d’agarose		Thermo Fischer Scientific
Thermo	Fischer Scientific	B1A-BP
Alpha D-(+)-lactose monohydraté	Thermo Fischer Scientific	18-600-440
Tubes à centrifuger ambrés de 1,5 mL	Thermo Fischer Scientific	d’ammonium
(APS)	Sigma-Aldrich	A3678
Sulfate d’ammonium ((NH4)2SO4)	Sigma-Aldrich	A4418
Attune NxT Cytomètre en flux	Thermo Fischer Scientific	A24861
Attune 1x Focusing Fluid	Thermo Fischer Scientific	A24904
Attune Shutdown Solution	Thermo Fischer Scientific	A24975
Perles de suivi des performances Thermo	Fischer Scientific	4449754
Attune Wash Solution	Thermo Fischer Scientific	; J24974
Acide borique	Sigma-Aldrich	B6768
Bleu de bromophénol	Sigma-Aldrich	B0126
Sel disodique de la carbenicilline	Sigma-Aldrich	C3416
Eau de Javel	Amazon	B07J6FJR8D
Corning Costar Plaque à 96 puits	Daigger Scientific	EF86610A
Tubes de culture, 12 mm x 75 mm, 5 mL avec capuchon à double position Globe	Scientific	05-402-31
DFHBI	Sigma-Aldrich	SML1627
DFHBI-1T	Sigma-Aldrich	SML2697
D-Glucose (anhydre)	Acros Organics	AC410955000
Dimethyl sulfoxyde (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	DTT-RO
Colorant de chargement d’ADN	New England Biolabs	B7025S
DNA LoBind Tubes (2,0 mL)	Eppendorf	22431048
dNTP : dATP, dCTP, dGTP, dTTP	New England Biolabs	N0446S
EDTA, pH 8,0	Gibco, Life Technologies	AM9260G
Ethanol (EtOH)	Sigma-Aldrich	E7023
Pointes de micropipette à pointe de filtre	Thermo Fischer Scientific	AM12635, AM12648, AM12655, AM12665
Logiciel FlowJo	BD Biosciences	N/A	Logiciel FlowJo v10
Lecteur de plaques fluorescentes avec commande de chauffage	VWR	10014-924
Alimentation par électrophorèse sur gel	Thermo Fischer Scientific	EC3000XL2
Glycérol	Sigma-Aldrich	G5516
Glycogène AM95010	Thermo Fischer Scientific	AM95010
GraphPad Prism	Dotmatics	N/A	Logiciel d’analyse de Academic Group License  ;
Bloc de chaleur  ;	Thomas Scientific	1159Z11
HEPES	Sigma-Aldrich	H-4034
Pyrophosphatase inorganique	Sigma-Aldrich	I1643-500UN
Échelle d’ADN de faible poids moléculaire	New England Biolabs	N3233L	Fourni avec flacon gratuit de colorant de chargement de gel, violet (6x), pas de FDS (NEB #B7025).
Chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M2670
Sulfate de magnésium (MgSO4)	Fisher Scientific	MFCD00011110 Tubes à
microcentrifuger (1,5 mL)	Eppendorf	22363204
Microcentrifugeuse avec contrôle de la température	Marshall Scientific	EP-5415R
Micropipettes	Gilson	FA10001M, FA10003M, FA10005M FA10006M
Pointes de micropipette	Sigma-Aldrich	Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR
Filtre à eau Millipore avec unité BioPak	Sigma-Aldrich	CDUFBI001, ZRQSVR3WW
Pointes de pipette micropipette étroites	DOT Scientific	RN005R-LRS
PBS, 10x	Thermo Fischer Scientific	BP39920
Kit de nettoyage PCR	Qiagen	28181
Amorces et modèles	PCR Technologies d’ADN
Thermocycleur PCR pour tubes PCR à paroi mince	Bio-Rad	1851148
Thermocycleur PCR pour tubes de 0,5 mL	Techne	5PRIME/C
pET31b-T7-Spinach2 Plasmide	Addgene	Plasmide #79783
Phusion ADN polymérase haute fidélité  ;	New England Biolabs	M0530L	L’achat de l’enzyme Phusion High-Fideldity est fourni avec 5 tampons Phusion HF, 5 tampons Phusion GC et des solutions MgCl2 et DMSO.
Peigne à gel d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide, C.B.S. Scientific	C.B.S. Scientific	VGC-1508
Équipement d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide	C.B.S. Scientific	ASG-250
Chlorure de potassium (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Phosphate de potassium monobasique	Sigma-Aldrich	P5655
Lames de rasoir	Genesee Scientific	38-101
rNTP : ATP, CTP, GTP, UTP	New England Biolabs	N0450L
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
Source de lumière UV à ondes courtes	Thermo Fischer Scientific	11758221
Carbonate de sodium (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S7795
Sodium chlorure (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Hydroxyde de sodium (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
Phosphate de sodium dibasique, anhydre	Thermo Fischer Scientific	S375-500
SoftMax Pro	Molecular Devices	N/A	SoftMax Pro 6.5.1 (logiciel de lecture de plaques) obtenu par le biais d’une licence de groupe académique
Unités de filtration stériles	Thermo Fischer Scientific	09-741-88
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389
SYBR Coloration sûre au gel d’ADN	Thermo Fischer Scientific	S33102
Tampon TAE pour électrophorèse sur gel d’agarose	Thermo Fischer Scientific	AM9869
Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
Base	TrisSigma-Aldrich	TRIS-RO
Tryptone (granulé)	Thermo Fischer Scientific	M0251S
T7 ARN polymérase	New England Biolabs	M0251S
Urea-PAGE Système de gel  ;	National Diagnostics	EC-833
Plaque TLC fluorescente UV	Sigma-Aldrich	1.05789.0001
Spectrophotomètre UV/Vis	Thermo Fischer Scientific	ND-8000-GL
Mélangeur vortex	Thermo Fischer Scientific	2215415
Xylène cyanol	Sigma-Aldrich	X4126
Extrait de levure (granulé)	Thermo Fischer Scientific	BP9727-2