Designe en bioreaktor for å forbedre datainnsamling og modellere gjennomstrømning av konstruert hjertevev

Summary

Tredimensjonalt hjertevev bioengineered ved hjelp av stamcelleavledede kardiomyocytter har dukket opp som lovende modeller for å studere sunt og sykt humant myokard in vitro , samtidig som de rekapitulerer viktige aspekter ved den opprinnelige hjertenisjen. Dette manuskriptet beskriver en protokoll for fremstilling og analyse av høyt innhold konstruert hjertevev generert fra humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter.

Abstract

Hjertesvikt er fortsatt den ledende dødsårsaken over hele verden, noe som skaper et presserende behov for bedre prekliniske modeller av det menneskelige hjerte. Vevsteknikk er avgjørende for grunnvitenskapelig hjerteforskning; in vitro human cellekultur eliminerer forskjellene mellom artene i dyremodeller, mens et mer vevslignende 3D-miljø (f.eks. med ekstracellulær matrise og heterocellulær kobling) simulerer in vivo-forhold i større grad enn tradisjonell todimensjonal kultur på petriskåler av plast. Imidlertid krever hvert modellsystem spesialisert utstyr, for eksempel spesialdesignede bioreaktorer og funksjonelle vurderingsenheter. I tillegg er disse protokollene ofte kompliserte, arbeidskrevende og plaget av svikt i de små, delikate vevene.

Denne artikkelen beskriver en prosess for å generere et robust humant konstruert hjertevev (hECT) modellsystem ved bruk av induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter for langsgående måling av vevsfunksjon. Seks hekter med lineær stripegeometri dyrkes parallelt, med hver hECT suspendert fra et par kraftfølende polydimetylsiloksan (PDMS) innlegg festet til PDMS-stativer. Hvert innlegg er avkortet med en svart PDMS stabil postsporing (SPoT), en ny funksjon som forbedrer brukervennligheten, gjennomstrømningen, vevsretensjonen og datakvaliteten. Formen muliggjør pålitelig optisk sporing av postavbøyninger, noe som gir forbedrede rykningskraftsporinger med absolutt aktiv og passiv spenning. Hettegeometrien eliminerer vevssvikt på grunn av at hekter glir av stolpene, og da de involverer et andre trinn etter PDMS-rackfabrikasjon, kan SPoTs legges til eksisterende PDMS-postbaserte design uten store endringer i bioreaktorfabrikasjonsprosessen.

Systemet brukes til å demonstrere viktigheten av å måle hECT-funksjonen ved fysiologiske temperaturer og viser stabil vevsfunksjon under datainnsamling. Oppsummert beskriver vi et toppmoderne modellsystem som reproduserer viktige fysiologiske forhold for å fremme biofidelitet, effektivitet og strenghet av konstruerte hjertevev for in vitro-applikasjoner .

Introduction

Konstruerte hjertevevsmodeller kommer i et mangfoldig utvalg av geometrier og konfigurasjoner for å rekapitulere ulike aspekter av den opprinnelige hjertenisjen som er vanskelig å oppnå med tradisjonell todimensjonal cellekultur. En av de vanligste konfigurasjonene er den lineære vevsstrimmelen^, med fleksible ankre i hver ende for å indusere vevets selvmontering og gi vevet en definert forspenning og en avlesning av de resulterende rykningskreftene 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
^,22,23,24,25,26,27. Kraften som genereres kan bestemmes robust gjennom optisk sporing av vevsforkortelsen og ved hjelp av elastisk stråleteori for å beregne kraften fra de målte avbøyningene og fjærkonstanten til ankrene 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11^, 12,13,14,15,16,17,18,19,20^,
21,22,25,26,28.

Imidlertid er hjertevevsteknikk fortsatt et utviklende felt, og noen utfordringer gjenstår. Spesialutstyr, for eksempel skreddersydde bioreaktorer og funksjonelle vurderingsenheter, kreves for hvert modellsystem 10,29,30,31. Størrelsen og kompleksiteten til mikromiljøet til disse konstruksjonene er ofte begrenset av lav gjennomstrømning på grunn av arbeidsintensive protokoller, høyt antall celler og vevssårbarhet. For å løse dette har noen grupper vendt seg til fabrikasjon av mikrovev som bare inneholder hundrevis eller tusenvis av celler for å lette analyser med høy gjennomstrømning som er nyttige for narkotikaforskning. Denne reduserte skalaen kompliserer imidlertid den nøyaktige vurderingen av funksjon¹², eliminerer viktige aspekter ved den opprinnelige hjertenisjen (som næringsstoffer / oksygendiffusjonsgradienter og kompleks arkitektur³⁶), og begrenser mengden materiale som er tilgjengelig for påfølgende molekylær og strukturell analyse (som ofte krever sammenslåing av vevene). Tabell 1 oppsummerer noen av konfigurasjonene av lineære vevsstrimmelmodeller i litteraturen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15^, 16,17,18,19,20^,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.

Gruppe		Celler per vev	Vev per plate	Plate format		Forankringsfunksjon		Metode for funksjonell datainnsamling		Delt mediebad?	Funksjonelt mål- ment in situ?
Yoshida (ECT) 38		4 millioner	6	modifisert 6-brønns plate*		Kraft-svinger		Direkte kraftmåling		Nei	Nei
Chan (hESC-CM-ECTs)26		310 k	6	Tilpasset 6-brønns tallerken		PDMS innlegg		Direkte kraftmåling		Ja	Nei
Feinberg (dyn-EHT)16		1,5 millioner	6	Tilpasset 6-brønns tallerken		PDMS ledning		vev form		Nei	Ja
RADISIC (BioWire)39, 40		110 k	8			polymer wire		Tråd form		Ja	Ja
Costa (enkelt hekt)1, 2		1-2 millioner	4**	10 cm petriskål**		PDMS innlegg		optisk avbøyning (kant-/objektsporing)		Ja	Ja
Costa (flere hekt) 3–9		500 K-1 millioner	6	6 cm petriskål		PDMS innlegg		optisk avbøyning (kant-/objektsporing)		Ja	Ja
Costa (multi-hECT m / SPoT)		1 millioner	6	6 cm petriskål		PDMS-innlegg med svarte caps		optisk avbøyning (objektsporing)		Ja	Ja
Passier (EHT)17		245 k	36	12-brønns plate		PDMS-innlegg med svarte caps		optisk avbøyning (objektsporing)		Ja	Ja
Vunjak-Novakovic13, 18		1 millioner	12	6 cm petriskål		PDMS-innlegg med caps		optisk avbøyning (kantdeteksjon)		Ja	Ja
Vunjak-Novakovic (MilliPillar)14		550 k	6	Tilpasset 6-brønns tallerken		PDMS-innlegg med caps		optisk avbøyning (objektsporing); kalsium avbildning		Nei	Ja
Eschenhagen (EHT)10, 19–21		1 millioner	12	12-brønns plate		PDMS-innlegg med caps		optisk avbøyning (kantdeteksjon av post avbøyning); kalsium avbildning		Nei	Ja
Zandstra (CaMiRi)22		25-150 k	96	96-brønns plate		PDMS-innlegg med kroker		optisk avbøyning (kantdeteksjon)		Nei	Ja
Murry23, 24		900 k	24	24-brønns plate		PDMS-stolper med caps, integrert magnet		magnetisk sensor		Nei	Ja
Riket (μTUG)11, 12, 25		Udefinert	156	156-brønns tallerken		PDMS-stolper med caps, integrert magnet		optisk sporing (fluorescerende perle)		Ja	Ja

Tabell 1: Karakteristika for noen lineærkonstruerte hjertevevsmodeller i litteraturen. Lineærkonstruerte hjertevevsmodeller varierer i størrelse, gjennomstrømning, forankringsfunksjonsdesign og tilrettelegging av delte mellomstore bad, samt kravene til et eget muskelbadsystem for funksjonell karakterisering. * Forskerne brukte et kommersielt tilgjengelig konstruert vevssystem basert på dimensjonene til en standard 6-brønnsplate. ** Et modulært system der enkeltvevsbioreaktorer er forankret til en hvilken som helst plastkulturskål i ønsket antall og plassering.

Dette papiret beskriver den nyeste protokollen for å fremstille vår etablerte modell av lineært humant konstruert hjertevev (hECT) 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 og metoder for vurdering av hECT-kontraktil funksjon. Hver bioreaktor med flere vev har plass til opptil seks hektar i et delt mediumbad og består av to “rack” -stykker laget av silikonelastomerpolydimetylsiloksan (PDMS) montert på en stiv polysulfonramme. Hvert PDMS-stativ inneholder seks fleksible integrerte kraftsensorstolper som er 0,5 mm i diameter og 3,25 mm lange, og sammen gir to stativer seks par stolper, som hver har en hECT. Inversjon av bioreaktoren bidrar til å overvinne enhver hindring for visualisering av hektene nedenfra på grunn av vannkondens fra kulturmediet eller forvrengninger fra menisken i luft-væske-grensesnittet. Hver sammentrekning av en hECT forårsaker avbøyning av de integrerte endestolpene, og den optiske målingen av avbøyningssignalet behandles til en kraft-mot-tidssporing som representerer den kontraktile funksjonen til hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . Sammenlignet med enkeltvevsbioreaktorene som vanligvis brukes til vev av denne størrelsen, forbedrer multivevsdesignet den eksperimentelle gjennomstrømningen og muliggjør studier av parakrin signalering mellom tilstøtende vev med potensielt forskjellig cellulær sammensetning. Dette systemet har blitt validert i publiserte studier som beskriver anvendelser i sykdomsmodellering ^4,8, parakrin signalering ^6,7, heterocellulær kultur ^5,9 og terapeutisk screening ^7,9.

I dette systemet er hECT-ene designet for å være omtrent 6 mm lange og 0,5 mm i diameter for å muliggjøre robust optisk sporing av kraftmålinger med lite støy. Videre er aspekter av vevskompleksitet som diffusjonsgradienter og cellulær organisasjon balansert med et håndterbart krav på 1 million celler per vev. Med standard CCD-kamerateknologi genererer krefter så svake som 1 μN (som representerer mindre enn 5 μm etter nedbøyning) et klart signal, noe som sikrer at selv ekstremt svak kontraktil funksjon, som observert med noen hECT-sykdomsmodeller, kan måles nøyaktig. Dette forenkler også den detaljerte analysen av rykningskraftkurven, og muliggjør dermed analyse av høyt innhold av opptil 16 kontraktilitetsmålinger⁴¹, inkludert utviklet kraft, sammentrekningshastigheter (+dF/dt) og avslapning (-dF/dt) og variasjon i slaghastighet.

Denne protokollen begynner med instruksjoner for fremstilling av bioreaktorkomponentene. Spesiell oppmerksomhet rettes mot trinnene for å maksimere hECT-utbyttet, redusere teknisk variasjon i vevsfunksjonen og optimalisere kvaliteten og dybden av vevsvurderingen. De fleste hjertevevstekniske studier rapporterer ikke frekvenser av vevstap under fabrikasjon og langsiktig testing, selv om det er en kjent utfordring i feltet og reduserer gjennomstrømningen og effektiviteten til studiene²⁷. De vevstekniske metodene beskrevet her har blitt raffinert gjennom årene for å sikre oppbevaring av alle hECTs i de fleste bioreaktorer (uavhengig av hvordan PDMS-stativene er produsert). Selv 5% -20% tap av vev kan imidlertid påvirke den statistiske styrken betydelig, spesielt i mindre eksperimenter begrenset av antall tilgjengelige kardiomyocytter (f.eks. på grunn av differensieringsutfordringer med noen syke cellelinjer⁴ eller på grunn av høye kostnader for kommersielt kjøpte kardiomyocytter), eller ved behandlingstilstanden (f.eks. begrenset tilgjengelighet eller høye kostnader for forskjellige behandlingsforbindelser).

Denne protokollen beskriver fabrikasjon av stabile postsporere (SPoTs), en ny funksjon i PDMS-rackene, som fungerer som caps i enden av kraftfølerstolpene som holder hECTs²⁷. Det er demonstrert hvordan hettegeometrien signifikant reduserer hECT-tapet fra å falle eller trekke av stolpene, og dermed åpne nye muligheter for dyrking av hECTs med større variasjon av stivheter og spenninger, som er utfordrende for kultur på uavkortede innlegg. I tillegg gir SPoTs et objekt med høy kontrast for å forbedre den optiske sporingen av hECT-sammentrekningen gjennom en konsekvent og veldefinert form²⁷. Dette etterfølges av en beskrivelse av dyrking av humaninduserte pluripotente stamceller (iPSCs) og kardiomyocyttdifferensiering basert på tidligere publiserte protokoller ^3,42,43 og en forklaring av hECT-fabrikasjon, kultur og funksjonelle målinger.

Denne artikkelen tar også for seg behovet for å måle vevsfunksjonen ved fysiologisk temperatur. Humant myokard (føtalt så vel som voksent sunt og sykt vev), samt hjertevev fra et bredt spekter av dyrearter (inkludert rotter, katter, mus, ildere og kaniner)^44,45, viser en markert økning i frekvensmatchet rykningskraft ved temperaturer på 28 ° C-32 ° C sammenlignet med fysiologisk temperatur – et fenomen kjent som hypoterm inotropi^{45, 46}. Imidlertid forblir effekten av temperatur på konstruert myokardvevsfunksjon understudert. Mange nyere konstruerte hjertevevsmodeller i litteraturen er designet for å bli funksjonelt vurdert ved 37 °C for å tilnærme fysiologiske forhold 13,14,37. Men så vidt vi vet, har de temperaturavhengige effektene på kraften generert av konstruerte hjertevev ikke blitt systematisk undersøkt. Denne protokollen beskriver en pacingelektrodedesign som minimerer varmetap under testing, samt tillater inkorporering av et isolert varmeelement i oppsettet for funksjonelle målinger, som kan opprettholde hektene ved fysiologisk temperatur uten at det går ut over steriliteten²⁷. Vi rapporterer deretter noen av de observerte effektene av temperatur på hECT-funksjonen, inkludert på den utviklede kraften, spontan slagfrekvens, +dF / dt og -dF / dt. Til sammen gir dette papiret detaljene som kreves for å produsere dette multi-tissue force-sensing bioreaktorsystemet for å fremstille humant konstruert hjertevev og å vurdere deres kontraktile funksjon, og et sett med data presenteres som gir et sammenligningsgrunnlag for målinger ved romtemperatur og ved 37 ° C²⁷.

Protocol

Denne protokollen brukte en avidentifisert iPSC-linje, SkiPS 31.3 (opprinnelig omprogrammert ved hjelp av dermale fibroblaster fra en sunn 45 år gammel mann)47, og var dermed unntatt fra spesifikk godkjenning fra Institutional Review Board, i samsvar med institusjonens retningslinjer for human forskningsetikk. Utfør all celle- og hECT-manipulering under aseptiske forhold i et HEPA-filtrert biologisk sikkerhetskabinett i klasse II eller laminær strømningsarbeidsbenk. Steriliser alle ikke-steril…

Representative Results

Etter protokollen ovenfor ble kardiomyocytter generert fra en sunn iPSC-linje som tidligere ble brukt av vår gruppe 9,15 og fremstilt i hektar etter 8-61 dager i kultur. Figur 9A viser representative bilder av hECTs sett fra bunnen, som ble opprettet uten (øverst) og med (nederst) SPoTs. Funksjonsmålinger ble gjort ved romtemperatur (23 °C) og ved fysiologisk temperatur (36 °C) mellom 37 dager og 52 dager etter hECT-fabrikasjon….

Discussion

Det finnes mange lineærkonstruerte hjertevevsmodeller publisert i litteraturen, hvorav noen er beskrevet i tabell 1. Noen modeller involverer direkte måling av vevskraften, men disse krever vanligvis overføring av konstruksjonen til et eget muskelbad³⁸. De fleste modeller er designet med vevene permanent forankret i begge ender, oftest til PDMS-innlegg 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ^…

Materials

0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire	McMaster Carr	6517K61
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.7 mL Microtubes	Axygen	MCT-175-C
10 cm dishes (20 mm tall)	Corning	353003
10 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-010
10 N NaOH	Fisher Scientific	SS225-1	dilute 1:10 in sterile distilled water
10X Modified Eagle Medium	Sigma Aldrich	M0275
20 – 200 μL Micropipette	Eppendorf	3123000055
200 μL MicroPipette Tips	VWR	76322-150
5 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-005
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Falcon	352070
6 cm Petri Dish	Corning	353002
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator	AmScope	LED-6W
6-Well Plates	Corning	353046
90 degree angle mirror	Edmund Optics	45-594
Acrylic bonding glue	SCIGRIP	#4
Adjustable 10 cm x 10 cm jack	Fisher Scientific	14-673-50
Aluminum 6061	McMaster Carr	9008K82
A-Plan 10X Objective Lens	ZEISS	1020-863
Autoclave Bags	Propper	21002
B-27 supplement	ThermoFisher	17504044
B-27 supplement (without insulin)	ThermoFisher	A1895601
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Black ABS	Ultimaker		2.85 mm wide
Bovine Collagen I	Gibco	A1064401
CHIR99021	Tocris	4423
Class II Biosafety Cabinet	Labconco	3430009
Clear Acrylic Sheeting	estreetplastics	1002502436	6.25 mm thick
CNC Vertical Mill	Haas	VF-1
Conductive Graphite Bars	McMaster Carr	1763T33
Dissection microscope	Olympus	SZ61
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11330032
Ethanol	Fisher Scientific	A4094	Dilute to 70% in water
EVE Automated Cell counter	NanoEntek	E1000
EVE Cell Counting Slide	NanoEntek	EVS-050
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10438026
Fine Curved Forceps	Fine Science Tools	11253-25
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Electron Corporation	3110	AKA "incubator". With HEPA class 100 filter
Fusion360 software	Autodesk		AKA "CAD software"
Glass Hemocytometer	Reichert	1475	0.1 mm deep
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
hESC qualified matrigel	Corning	354277	AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots
High Speed CCD Camera	PixelLINK	P7410
Inverted Microscope	Carl Zeiss Werk	Axiovert 40 CFL	10X phase contrast objective
IWR-1	Selleck Chem	S7086
LabView Software	National Instruments	2016
Laminar flow clean bench	NuAire	NU-201-330	necessary for hECT functional analysis
Laptop	AsusTek	Strix	Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM
Laser Cutting Machine	Epilog	Helix 24
Magnification headset	ExcelBlades	70020	Recommended for steps requiring fine manipulations
Matlab	Mathworks	Version 2019b or later	AKA "data analysis software"
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade	WPI Instruments	501839
Microscope Boom Stand	Olympus	SZ2-STU1
Penicillin-Streptomycin stock solution	ThermoFisher	15140122	10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin
Phosphate-buffered saline without divalent cations	Sigma Aldrich	P3813	Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations
Pipette Controller	Drummond	4-000-100
PixelLINK Capture OEM	PixelLINK	10.2.1.6	AKA "Camera Software"
Polysulfone	McMaster Carr	86735K73	translucent amber color
Polytetrafluoroethylene (PTFE)	McMaster Carr	8545K176	Black, molded
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872	AKA "iPSC dissociation media"
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media	ThermoFisher	11875135
Silicone Sheeting	SMI manufacturing		glossy, 0.02 in thickness, durometer 40
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads	Michael's		color should withstand autoclaving
Spatula	Fisher Scientific	14-373	used for mixing PDMS
Square Pulse Stimulator	Astro-Med / Grass Technologies	S88X
Stainless Steel Razoblades	GEM	62-0179-CTN	preferred over non-stainless steel due to lower hardness
Stemflex	ThermoFisher	A3349401	AKA "iPSC culture media"
Sterile distilled water	ThermoFisher	5230
Sylgard 170 -  Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit	Dow	DOWSIL 170 2LB KIT	AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS)
Sylgard 184 – Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit	Dow	DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT	AKA Polydimethylsiloxane (PDMS)
Temperature-controlled heated stage	Okolab	H401-HG-SMU	Set height to 10 cm
Thermoplastic 3D printer	Ultimaker	Ultimaker 3
Thiazovivin	Selleck Chem	S1459
Trypan Blue	NanoEntek	EBT-001
Vacuum Chamber	Bel-Art Parts	F42027-0000
Variable Speed Mini Band Saw	Micro-Mark	82203
Variable Speed Miniature Drill Press	Micro-Mark	82959
Vibration Isolation Table	Labconco	3618000
Weighing Boats	VWR	10803-140
Talon Cylinder Bench Clamp	VWR	97035-528	AKA screw clamp