Tredimensionell hjärtvävnad som biokonstruerats med hjälp av stamcellshärledda kardiomyocyter har dykt upp som lovande modeller för att studera friskt och sjukt humant myokardium in vitro samtidigt som man rekapitulerar viktiga aspekter av den ursprungliga hjärtnischen. Detta manuskript beskriver ett protokoll för tillverkning och analys av högteknologisk hjärtvävnad genererad från humana inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter.
Hjärtsvikt är fortfarande den vanligaste dödsorsaken i världen, vilket skapar ett stort behov av bättre prekliniska modeller av det mänskliga hjärtat. Vävnadsteknik är avgörande för grundvetenskaplig hjärtforskning; In vitro human cellodling eliminerar skillnaderna mellan arterna i djurmodeller, medan en mer vävnadsliknande 3D-miljö (t.ex. med extracellulär matris och heterocellulär koppling) simulerar in vivo-förhållanden i större utsträckning än traditionell tvådimensionell odling på petriskålar av plast. Varje modellsystem kräver dock specialutrustning, till exempel specialdesignade bioreaktorer och funktionsbedömningsenheter. Dessutom är dessa protokoll ofta komplicerade, arbetsintensiva och plågas av att de små, ömtåliga vävnaderna misslyckas.
Denna artikel beskriver en process för att generera ett robust humant konstruerat hjärtvävnadsmodellsystem (hECT) med hjälp av inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter för longitudinell mätning av vävnadsfunktion. Sex hECT:er med linjär bandgeometri odlas parallellt, där varje hECT är upphängd i ett par kraftavkännande polydimetylsiloxanstolpar (PDMS) fästa vid PDMS-rack. Varje inlägg är täckt med en svart PDMS stabil postspårare (SPoT), en ny funktion som förbättrar användarvänligheten, genomströmningen, vävnadsretentionen och datakvaliteten. Formen möjliggör tillförlitlig optisk spårning av stolpavböjningar, vilket ger förbättrade ryckkraftsspårningar med absolut aktiv och passiv spänning. Kapsylgeometrin eliminerar vävnadsfel på grund av att hECT:er glider av stolparna, och eftersom de involverar ett andra steg efter PDMS-racktillverkning kan SPoTs läggas till befintliga PDMS-efterbaserade konstruktioner utan större förändringar i bioreaktortillverkningsprocessen.
Systemet används för att demonstrera vikten av att mäta hECT-funktionen vid fysiologiska temperaturer och visar stabil vävnadsfunktion under datainsamlingen. Sammanfattningsvis beskriver vi ett state-of-the-art modellsystem som reproducerar viktiga fysiologiska förhållanden för att främja biotrohet, effektivitet och noggrannhet hos konstruerad hjärtvävnad för in vitro-applikationer .
Konstruerade hjärtvävnadsmodeller finns i en mängd olika geometrier och konfigurationer för att rekapitulera olika aspekter av den ursprungliga hjärtnischen som är svåra att uppnå med traditionell tvådimensionell cellodling. En av de vanligaste konfigurationerna är den linjära vävnadsremsan, med flexibla ankare i varje ände för att inducera självorganisering av vävnaden och förse vävnaden med en definierad förspänning och en avläsning av de resulterande ryckkrafterna 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
,22,23,24,25,26,27. Den genererade kraften kan bestämmas på ett robust sätt genom optisk spårning av vävnadsförkortningen och med hjälp av elastisk strålteori för att beräkna kraften från de uppmätta avböjningarna och fjäderkonstanten för ankarna 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,
21,22,25,26,28.
Hjärtvävnadsteknik är dock fortfarande ett område under utveckling, och vissa utmaningar kvarstår. Specialiserad utrustning, såsom specialtillverkade bioreaktorer och funktionsbedömningsanordningar, krävs för varje modellsystem 10,29,30,31. Storleken och komplexiteten hos mikromiljön för dessa konstruktioner begränsas ofta av låg genomströmning på grund av arbetsintensiva protokoll, ett stort antal celler och vävnadsbräcklighet. För att ta itu med detta har vissa grupper vänt sig till tillverkning av mikrovävnader som endast innehåller hundratals eller tusentals celler för att underlätta analyser med hög genomströmning som är användbara för läkemedelsupptäckt. Denna reducerade skala komplicerar dock den exakta bedömningen av funktion12, eliminerar viktiga aspekter av den ursprungliga hjärtnischen (såsom närings-/syrediffusionsgradienter och komplex arkitektur36) och begränsar mängden material som är tillgängligt för efterföljande molekylär och strukturell analys (vilket ofta kräver poolning av vävnaderna). Tabell 1 sammanfattar några av konfigurationerna av linjära vävnadsremsmodeller i litteraturen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.
Grupp | Celler per vävnad | Vävnader per platta | Plattans format | Funktion för förankring | Funktionell datainsamlingsmetod | Delat mediabad? | Funktionellt mått- på plats? |
||||
Yoshida (ECT)38 | 4 miljoner | 6 | Modifierad 6-hålsplatta* | Kraftgivare | Direkt kraftmätning | Nej | Nej | ||||
Chan (hESC-CM-ECT)26 | 310 k-lopp | 6 | anpassad 6-brunns maträtt | PDMS-inlägg | Direkt kraftmätning | Ja | Nej | ||||
Feinberg (dyn-EHT)16 | 1,5 miljoner | 6 | anpassad 6-brunns maträtt | PDMS-kabel | vävnadens form | Nej | Ja | ||||
RADISIC (BioWire)39, 40 | 110 km-lopp | 8 | Tråd av polymer | Trådens form | Ja | Ja | |||||
Costa (enkel hECT)1, 2 | 1-2 miljoner | 4** | 10 cm petriskål** | PDMS-inlägg | Optisk avböjning (kant-/objektspårning) | Ja | Ja | ||||
Costa (multi-hECT)3–9 | 500 K-1 miljon | 6 | 6 cm petriskål | PDMS-inlägg | Optisk avböjning (kant-/objektspårning) | Ja | Ja | ||||
Costa (multi-hECT med SPoT) | 1 miljon | 6 | 6 cm petriskål | PDMS-stolpar med svarta lock | Optisk avböjning (objektspårning) | Ja | Ja | ||||
Passier (EHT)17 | 245 k-lopp | 36 | Tallrik med 12 brunnar | PDMS-stolpar med svarta lock | Optisk avböjning (objektspårning) | Ja | Ja | ||||
Vunjak-Novakovic13, 18 | 1 miljon | 12 | 6 cm petriskål | PDMS-stolpar med lock | Optisk avböjning (kantdetektering) | Ja | Ja | ||||
Vunjak-Novakovic (MilliPillar)14 | 550 km-lopp | 6 | anpassad 6-brunns maträtt | PDMS-stolpar med lock | optisk avböjning (objektspårning); Kalcium avbildning | Nej | Ja | ||||
Eschenhagen (EHT)10, 19–21 | 1 miljon | 12 | Tallrik med 12 brunnar | PDMS-stolpar med lock | optisk avböjning (kantdetektering av efterböjning); Kalcium avbildning | Nej | Ja | ||||
Zandstra (CaMiRi)22 | 25-150 km-lopp | 96 | Platta med 96 brunnar | PDMS-stolpar med krokar | Optisk avböjning (kantdetektering) | Nej | Ja | ||||
Murry23, 24 | 900 km-lopp | 24 | Tallrik med 24 brunnar | PDMS-stolpar med lock, integrerad magnet | Magnetisk sensor | Nej | Ja | ||||
Reich (μTUG)11, 12, 25 | odefinierad | 156 | Skål med 156 brunnar | PDMS-stolpar med lock, integrerad magnet | Optisk spårning (fluorescerande pärla) | Ja | Ja |
Tabell 1: Karakteristika för några linjärt konstruerade hjärtvävnadsmodeller i litteraturen. Linjärt konstruerade hjärtvävnadsmodeller varierar i storlek, genomströmning, förankringsfunktionsdesign och underlättande av delade mediumbad, samt kraven på ett separat muskelbadsystem för funktionell karakterisering. * Forskarna använde ett kommersiellt tillgängligt konstruerat vävnadssystem baserat på måtten på en standard 6-hålsplatta. ** Ett modulärt system där bioreaktorer med en enda vävnad förankras i valfri plastodlingsskål i önskat antal och på önskad plats.
Denna artikel beskriver det senaste protokollet för tillverkning av vår etablerade modell av linjär humaniserad hjärtvävnad (hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 och metoder för att bedöma hECT:s kontraktila funktion. Varje bioreaktor med flera vävnader rymmer upp till sex hECT:er i ett gemensamt mediumbad och består av två “rack”-bitar gjorda av silikonelastomeren polydimetylsiloxan (PDMS) monterad på en styv polysulfonram. Varje PDMS-rack innehåller sex flexibla integrerade kraftavkännande stolpar som är 0,5 mm i diameter och 3,25 mm långa, och tillsammans ger två rack sex par stolpar, som var och en rymmer en hECT. Inversion av bioreaktorn hjälper till att övervinna eventuella hinder för visualisering av hECT:erna underifrån på grund av vattenkondensation från odlingsmediet eller distorsioner från menisken i luft-vätskegränssnittet. Varje sammandragning av en hECT orsakar avböjning av de integrerade ändstolparna, och den optiska mätningen av avböjningssignalen bearbetas till en kraft- kontra tidsspårning som representerar hECT:s sammandragningsfunktion 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . Jämfört med de bioreaktorer med en enda vävnad som vanligtvis används för vävnader av denna storlek, förbättrar designen med flera vävnader den experimentella genomströmningen och möjliggör studier av parakrin signalering mellan intilliggande vävnader med potentiellt olika cellulär sammansättning. Detta system har validerats i publicerade studier som beskriver tillämpningar inom sjukdomsmodellering 4,8, parakrin signalering 6,7, heterocellulär odling 5,9 och terapeutisk screening 7,9.
I detta system är hECT:erna utformade för att vara cirka 6 mm långa och 0,5 mm i diameter för att underlätta robust optisk spårning av kraftmätningar med lågt brus. Dessutom balanseras aspekter av vävnadskomplexitet såsom diffusionsgradienter och cellulär organisation med ett hanterbart behov av 1 miljon celler per vävnad. Med standard CCD-kamerateknik genererar krafter så svaga som 1 μN (vilket motsvarar mindre än 5 μm efterböjning) en tydlig signal, vilket säkerställer att även extremt svag kontraktil funktion, som observerats med vissa hECT-sjukdomsmodeller, kan mätas exakt. Detta underlättar också den detaljerade analysen av ryckkraftskurvan, vilket möjliggör analys med högt innehåll av upp till 16 kontraktilitetsmått41, inklusive utvecklad kraft, kontraktionshastigheter (+dF/dt) och relaxation (−dF/dt) och variationsfrekvens i svävningshastigheten.
Detta protokoll börjar med instruktioner för tillverkning av bioreaktorkomponenterna. Särskild uppmärksamhet ägnas åt stegen för att maximera hECT-utbytet, minska den tekniska variationen i vävnadsfunktionen och optimera kvaliteten och djupet i vävnadsbedömningen. De flesta studier av hjärtvävnadsteknik rapporterar inte vävnadsförlust under tillverkning och långtidstestning, även om det är en välkänd utmaning inom området ochminskar genomströmningen och effektiviteten i studierna. De vävnadstekniska metoder som beskrivs här har förfinats under årens lopp för att säkerställa retention av alla hECT:er i de flesta bioreaktorer (oavsett hur PDMS-racken är tillverkade). Men även en förlust av vävnader på 5–20 % kan avsevärt påverka den statistiska styrkan, särskilt i mindre experiment som begränsas av antalet tillgängliga kardiomyocyter (t.ex. på grund av differentieringsutmaningar med vissa sjuka cellinjer4 eller på grund av den höga kostnaden för kommersiellt inköpta kardiomyocyter), eller av behandlingstillståndet (t.ex. begränsad tillgänglighet eller höga kostnader för olika behandlingsföreningar).
Detta protokoll beskriver tillverkningen av stabila postspårare (SPoTs), en ny funktion i PDMS-racken, som fungerar som lock i ändarna av de kraftavkännande stolparna som håller hECTs27. Det demonstreras hur lockets geometri avsevärt minskar hECT-förlusten från att falla eller dra av stolparna, vilket öppnar nya möjligheter för att odla hECT med en större variation av styvheter och spänningar, vilket är utmanande att odla på otäckta stolpar. Dessutom ger SPoTs ett objekt med hög kontrast för att förbättra den optiska spårningen av hECT-kontraktionen genom en konsekvent och väldefinierad form27. Detta följs av en beskrivning av odling av humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) och kardiomyocytdifferentiering baserat på tidigare publicerade protokoll 3,42,43 och en förklaring av hECT-tillverkning, odling och funktionella mätningar.
Den här artikeln tar också upp behovet av att mäta vävnadsfunktion vid fysiologisk temperatur. Humant myokardium (frisk och sjuk vävnad hos foster och vuxna) samt hjärtvävnad från ett brett spektrum av djurarter (inklusive råttor, katter, möss, illrar och kaniner)44,45, uppvisar en markant ökning av den frekvensmatchade ryckkraften vid temperaturer på 28 °C–32 °C jämfört med fysiologisk temperatur – ett fenomen som kallas hypotermisk inotropi45. 46. veckor Effekterna av temperatur på den konstruerade myokardvävnadens funktion är dock fortfarande understuderade. Många nyare konstruerade hjärtvävnadsmodeller i litteraturen är utformade för att bedömas funktionellt vid 37 °C för att approximera fysiologiska förhållanden 13,14,37. Såvitt vi vet har dock de temperaturberoende effekterna på den kraft som genereras av konstruerad hjärtvävnad inte undersökts systematiskt. Detta protokoll beskriver en stimuleringselektroddesign som minimerar värmeförlusten under testningen, samt möjliggör införlivande av ett isolerat värmeelement i installationen för funktionella mätningar, vilket kan hålla hECT:erna vid fysiologisk temperatur utan att kompromissa med steriliteten27. Vi rapporterar sedan några av de observerade effekterna av temperatur på hECT-funktionen, inklusive på den utvecklade kraften, spontan slagfrekvens, +dF/dt och −dF/dt. Sammantaget ger denna artikel de detaljer som krävs för att tillverka detta kraftavkännande bioreaktorsystem för att tillverka mänsklig hjärtvävnad och för att bedöma deras kontraktila funktion, och en uppsättning data presenteras som ger en grund för jämförelse för mätningar vid rumstemperatur och vid 37 °C27.
Det finns ett stort antal linjärt konstruerade hjärtvävnadsmodeller publicerade i litteraturen, av vilka några beskrivs i tabell 1. Vissa modeller involverar direkt mätning av vävnadskraften, men dessa kräver vanligtvis att konstruktionen överförs till ett separat muskelbad38. De flesta modeller är utformade med vävnaderna permanent förankrade i båda ändar, oftast till PDMS-stolpar 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 <sup class="…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Dr. Timothy Cashman för tidigare arbete med denna metod. Denna studie finansierades av National Institutes of Health (NIH) (R01-HL132226 och K01 HL133424) och Leducq Foundation International Networks of Excellence Program (CURE-PLaN).
0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire | McMaster Carr | 6517K61 | |
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
1.7 mL Microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
10 cm dishes (20 mm tall) | Corning | 353003 | |
10 mL Serological Pipette | Drummond | 6-000-010 | |
10 N NaOH | Fisher Scientific | SS225-1 | dilute 1:10 in sterile distilled water |
10X Modified Eagle Medium | Sigma Aldrich | M0275 | |
20 – 200 μL Micropipette | Eppendorf | 3123000055 | |
200 μL MicroPipette Tips | VWR | 76322-150 | |
5 mL Serological Pipette | Drummond | 6-000-005 | |
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
6 cm Petri Dish | Corning | 353002 | |
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator | AmScope | LED-6W | |
6-Well Plates | Corning | 353046 | |
90 degree angle mirror | Edmund Optics | 45-594 | |
Acrylic bonding glue | SCIGRIP | #4 | |
Adjustable 10 cm x 10 cm jack | Fisher Scientific | 14-673-50 | |
Aluminum 6061 | McMaster Carr | 9008K82 | |
A-Plan 10X Objective Lens | ZEISS | 1020-863 | |
Autoclave Bags | Propper | 21002 | |
B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
B-27 supplement (without insulin) | ThermoFisher | A1895601 | |
Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Black ABS | Ultimaker | 2.85 mm wide | |
Bovine Collagen I | Gibco | A1064401 | |
CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
Class II Biosafety Cabinet | Labconco | 3430009 | |
Clear Acrylic Sheeting | estreetplastics | 1002502436 | 6.25 mm thick |
CNC Vertical Mill | Haas | VF-1 | |
Conductive Graphite Bars | McMaster Carr | 1763T33 | |
Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix | ThermoFisher | 11330032 | |
Ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Dilute to 70% in water |
EVE Automated Cell counter | NanoEntek | E1000 | |
EVE Cell Counting Slide | NanoEntek | EVS-050 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10438026 | |
Fine Curved Forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation | 3110 | AKA "incubator". With HEPA class 100 filter |
Fusion360 software | Autodesk | AKA "CAD software" | |
Glass Hemocytometer | Reichert | 1475 | 0.1 mm deep |
HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
hESC qualified matrigel | Corning | 354277 | AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots |
High Speed CCD Camera | PixelLINK | P7410 | |
Inverted Microscope | Carl Zeiss Werk | Axiovert 40 CFL | 10X phase contrast objective |
IWR-1 | Selleck Chem | S7086 | |
LabView Software | National Instruments | 2016 | |
Laminar flow clean bench | NuAire | NU-201-330 | necessary for hECT functional analysis |
Laptop | AsusTek | Strix | Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM |
Laser Cutting Machine | Epilog | Helix 24 | |
Magnification headset | ExcelBlades | 70020 | Recommended for steps requiring fine manipulations |
Matlab | Mathworks | Version 2019b or later | AKA "data analysis software" |
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade | WPI Instruments | 501839 | |
Microscope Boom Stand | Olympus | SZ2-STU1 | |
Penicillin-Streptomycin stock solution | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin |
Phosphate-buffered saline without divalent cations | Sigma Aldrich | P3813 | Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations |
Pipette Controller | Drummond | 4-000-100 | |
PixelLINK Capture OEM | PixelLINK | 10.2.1.6 | AKA "Camera Software" |
Polysulfone | McMaster Carr | 86735K73 | translucent amber color |
Polytetrafluoroethylene (PTFE) | McMaster Carr | 8545K176 | Black, molded |
ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | AKA "iPSC dissociation media" |
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media | ThermoFisher | 11875135 | |
Silicone Sheeting | SMI manufacturing | glossy, 0.02 in thickness, durometer 40 | |
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads | Michael's | color should withstand autoclaving | |
Spatula | Fisher Scientific | 14-373 | used for mixing PDMS |
Square Pulse Stimulator | Astro-Med / Grass Technologies | S88X | |
Stainless Steel Razoblades | GEM | 62-0179-CTN | preferred over non-stainless steel due to lower hardness |
Stemflex | ThermoFisher | A3349401 | AKA "iPSC culture media" |
Sterile distilled water | ThermoFisher | 5230 | |
Sylgard 170 - Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit | Dow | DOWSIL 170 2LB KIT | AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS) |
Sylgard 184 – Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit | Dow | DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT | AKA Polydimethylsiloxane (PDMS) |
Temperature-controlled heated stage | Okolab | H401-HG-SMU | Set height to 10 cm |
Thermoplastic 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 3 | |
Thiazovivin | Selleck Chem | S1459 | |
Trypan Blue | NanoEntek | EBT-001 | |
Vacuum Chamber | Bel-Art Parts | F42027-0000 | |
Variable Speed Mini Band Saw | Micro-Mark | 82203 | |
Variable Speed Miniature Drill Press | Micro-Mark | 82959 | |
Vibration Isolation Table | Labconco | 3618000 | |
Weighing Boats | VWR | 10803-140 | |
Talon Cylinder Bench Clamp | VWR | 97035-528 | AKA screw clamp |