Driedimensionale hartweefsels die bio-engineered zijn met behulp van van stamcellen afgeleide cardiomyocyten zijn naar voren gekomen als veelbelovende modellen voor het bestuderen van gezond en ziek menselijk myocardium in vitro , terwijl ze de belangrijkste aspecten van de inheemse cardiale niche recapituleren. Dit manuscript beschrijft een protocol voor het vervaardigen en analyseren van gemanipuleerde hartweefsels met een hoog gehalte die zijn gegenereerd uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten.
Hartfalen blijft wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak, waardoor er een dringende behoefte is aan betere preklinische modellen van het menselijk hart. Tissue engineering is cruciaal voor fundamenteel wetenschappelijk hartonderzoek; in vitro menselijke celkweek elimineert de verschillen tussen soorten van diermodellen, terwijl een meer weefselachtige 3D-omgeving (bijv. met extracellulaire matrix en heterocellulaire koppeling) in vivo omstandigheden in grotere mate simuleert dan traditionele tweedimensionale cultuur op plastic petrischalen. Elk modelsysteem vereist echter gespecialiseerde apparatuur, bijvoorbeeld op maat ontworpen bioreactoren en functionele beoordelingsapparatuur. Bovendien zijn deze protocollen vaak ingewikkeld, arbeidsintensief en worden ze geplaagd door het falen van de kleine, delicate weefsels.
Dit artikel beschrijft een proces voor het genereren van een robuust humaan gemanipuleerd hartweefsel (hECT) modelsysteem met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten voor de longitudinale meting van de weefselfunctie. Zes hECT’s met lineaire stripgeometrie worden parallel gekweekt, waarbij elke hECT wordt opgehangen aan een paar krachtgevoelige polydimethylsiloxaan (PDMS)-palen die aan PDMS-rekken zijn bevestigd. Elke post is afgedekt met een zwarte PDMS stable post tracker (SPoT), een nieuwe functie die het gebruiksgemak, de doorvoer, het vasthouden van weefsel en de gegevenskwaliteit verbetert. De vorm maakt het mogelijk om post-afbuigingen betrouwbaar optisch te volgen, wat resulteert in verbeterde twitch force tracings met absolute actieve en passieve spanning. De dopgeometrie elimineert weefselfalen als gevolg van hECT’s die van de palen glijden, en aangezien ze een tweede stap na de fabricage van PDMS-rekken inhouden, kunnen de SPoT’s worden toegevoegd aan bestaande PDMS-postgebaseerde ontwerpen zonder grote wijzigingen in het fabricageproces van de bioreactor.
Het systeem wordt gebruikt om het belang aan te tonen van het meten van de hECT-functie bij fysiologische temperaturen en toont een stabiele weefselfunctie tijdens data-acquisitie. Samenvattend beschrijven we een state-of-the-art modelsysteem dat belangrijke fysiologische omstandigheden reproduceert om de biotrouw, efficiëntie en nauwkeurigheid van gemanipuleerde hartweefsels voor in-vitrotoepassingen te bevorderen.
Gemanipuleerde hartweefselmodellen zijn er in een breed scala aan geometrieën en configuraties voor het recapituleren van verschillende aspecten van de oorspronkelijke cardiale niche die moeilijk te bereiken zijn met traditionele tweedimensionale celkweek. Een van de meest voorkomende configuraties is de lineaire weefselstrip, met flexibele ankers aan elk uiteinde om zelfassemblage van weefsel te induceren en het weefsel te voorzien van een gedefinieerde voorspanning en een uitlezing van de resulterende spiertrekkingen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
,22,23,24,25,26,27. De opgewekte kracht kan robuust worden bepaald door het optisch volgen van de weefselverkorting en het gebruik van de elastische bundeltheorie om de kracht te berekenen uit de gemeten doorbuigingen en de veerconstante van de ankers 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,
21,22,25,26,28.
Hartweefselengineering is echter nog steeds een evoluerend vakgebied en er blijven enkele uitdagingen bestaan. Gespecialiseerde apparatuur, zoals op maat gemaakte bioreactoren en functionele beoordelingsapparatuur, is vereist voor elk modelsysteem 10,29,30,31. De omvang en complexiteit van de micro-omgeving van deze constructen worden vaak beperkt door een lage doorvoer als gevolg van arbeidsintensieve protocollen, grote aantallen cellen en weefselkwetsbaarheid. Om dit aan te pakken, hebben sommige groepen zich gewend tot de fabricage van microweefsels die slechts honderden of duizenden cellen bevatten om high-throughput-assays mogelijk te maken die nuttig zijn voor het ontdekken van geneesmiddelen. Deze kleinere schaal bemoeilijkt echter de nauwkeurige beoordeling van functie12, elimineert belangrijke aspecten van de oorspronkelijke cardiale niche (zoals nutriënten/zuurstofdiffusiegradiënten en complexe architectuur36) en beperkt de hoeveelheid materiaal die beschikbaar is voor latere moleculaire en structurele analyse (waarbij vaak pooling van de weefsels nodig is). Tabel 1 geeft een overzicht van enkele configuraties van lineaire weefselstripmodellen in de literatuur 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.
Groep | Cellen per weefsel | Weefsels per plaat | Formaat van de plaat | Verankeringsfunctie | Methode voor het verzamelen van functionele gegevens | Gedeelde media bad? | Functionele maat- ter plaatse? |
||||
Yoshida (ECT)38 | 4 miljoen | 6 | Gemodificeerde plaat met 6 putjes* | kracht omvormer | Directe krachtmeting | Nee | Nee | ||||
Chan (hESC-CM-ECT’s)26 | 310 km-loop | 6 | Aangepaste schotel met 6 putjes | PDMS-berichten | Directe krachtmeting | ja | Nee | ||||
Feinberg (dyn-EHT)16 | 1,5 miljoen | 6 | Aangepaste schotel met 6 putjes | PDMS-draad | Vorm van het weefsel | Nee | ja | ||||
RADISIC (BioWire)39, 40 | 110 km-loop | 8 | polymeer draad | Vorm van de draad | ja | ja | |||||
Costa (enkele hECT)1, 2 | 1-2 miljoen | 4** | Petrischaaltje van 10 cm** | PDMS-berichten | Optische afbuiging (rand-/objecttracking) | ja | ja | ||||
Costa (multi-hECT)3–9 | 500 k-1 miljoen | 6 | 6 cm Petrischaal | PDMS-berichten | Optische afbuiging (rand-/objecttracking) | ja | ja | ||||
Costa (multi-hECT met SPoT) | 1 miljoen | 6 | 6 cm Petrischaal | PDMS-palen met zwarte doppen | Optische afbuiging (object volgen) | ja | ja | ||||
Passier (EHT)17 | 245 km-loop | 36 | Plaat met 12 putjes | PDMS-palen met zwarte doppen | Optische afbuiging (object volgen) | ja | ja | ||||
Vunjak-Novakovic13, 18 | 1 miljoen | 12 | 6 cm Petrischaal | PDMS-palen met doppen | Optische doorbuiging (randdetectie) | ja | ja | ||||
Vunjak-Novakovic (MilliPillar)14 | 550 km-loop | 6 | Aangepaste schotel met 6 putjes | PDMS-palen met doppen | optische afbuiging (volgen van objecten); Calcium beeldvorming | Nee | ja | ||||
Eschenhagen (EHT)10, 19–21 | 1 miljoen | 12 | Plaat met 12 putjes | PDMS-palen met doppen | optische afbuiging (randdetectie van na-afbuiging); Calcium beeldvorming | Nee | ja | ||||
Zandstra (CaMiRi)22 | 25 tot 150 km-loop | 96 | Plaat met 96 putjes | PDMS-palen met haken | Optische doorbuiging (randdetectie) | Nee | ja | ||||
Murry23, 24 | 900 km | 24 | Plaat met 24 putjes | PDMS-palen met doppen, geïntegreerde magneet | Magnetische sensor | Nee | ja | ||||
Reich (μTUG)11, 12, 25 | Ongedefinieerde | 156 | Schotel met 156 putjes | PDMS-palen met doppen, geïntegreerde magneet | optische tracking (fluorescerende kraal) | ja | ja |
Tabel 1: Kenmerken van enkele lineair gemanipuleerde hartweefselmodellen in de literatuur. Lineair gemanipuleerde hartweefselmodellen variëren in grootte, doorvoer, ontwerpen van verankeringskenmerken en het faciliteren van gedeelde mediumbaden, evenals de vereisten voor een afzonderlijk spierbadsysteem voor functionele karakterisering. * De onderzoekers gebruikten een in de handel verkrijgbaar gemanipuleerd weefselsysteem op basis van de afmetingen van een standaard plaat met 6 putjes. ** Een modulair systeem waarbij bioreactoren met één weefsel worden verankerd aan elk plastic kweekschaaltje in het gewenste aantal en op de gewenste locatie.
Dit artikel beschrijft het nieuwste protocol voor het vervaardigen van ons gevestigde model van lineair menselijk gemanipuleerd hartweefsel (hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 en methoden voor het beoordelen van de contractiele functie van hECT. Elke multi-weefsel bioreactor biedt plaats aan maximaal zes hECT’s in een gedeeld mediumbad en bestaat uit twee “rek”-stukken gemaakt van het siliconenelastomeer polydimethylsiloxaan (PDMS) gemonteerd op een stijf polysulfonframe. Elk PDMS-rek bevat zes flexibele geïntegreerde krachtdetectiepalen met een diameter van 0,5 mm en een lengte van 3,25 mm, en samen bieden twee rekken zes paar palen, die elk één hECT bevatten. Inversie van de bioreactor helpt bij het overwinnen van elke belemmering voor de visualisatie van de hECT’s van onderaf als gevolg van watercondensatie van het kweekmedium of vervormingen van de meniscus van de lucht-vloeistofinterface. Elke samentrekking van een hECT veroorzaakt afbuiging van de geïntegreerde eindposten, en de optische meting van het afbuigsignaal wordt verwerkt tot een kracht-versus-tijdtracering die de contractiele functie van de hECT weergeeft 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . Vergeleken met de bioreactoren met één weefsel die doorgaans worden gebruikt voor weefsels van deze grootte, verbetert het ontwerp met meerdere weefsels de experimentele doorvoer en maakt het de studie mogelijk van paracriene signalering tussen aangrenzende weefsels met een potentieel verschillende cellulaire samenstelling. Dit systeem is gevalideerd in gepubliceerde studies die toepassingen beschrijven in ziektemodellering 4,8, paracriene signalering 6,7, heterocellulaire cultuur 5,9 en therapeutische screening 7,9.
In dit systeem zijn de hECT’s ontworpen om ongeveer 6 mm lang en 0,5 mm in diameter te zijn om een robuuste optische tracking van krachtmetingen met weinig ruis mogelijk te maken. Bovendien worden aspecten van weefselcomplexiteit, zoals diffusiegradiënten en cellulaire organisatie, in evenwicht gehouden met een beheersbare behoefte van 1 miljoen cellen per weefsel. Met standaard CCD-cameratechnologie genereren krachten zo zwak als 1 μN (minder dan 5 μm na afbuiging) een duidelijk signaal, zodat zelfs extreem zwakke contractiele functie, zoals waargenomen bij sommige hECT-ziektemodellen, nauwkeurig kan worden gemeten. Dit vergemakkelijkt ook de gedetailleerde analyse van de twitch-krachtcurve, waardoor de analyse met een hoog gehalte van maximaal 16 contractiliteitsmetrieken41 mogelijk wordt, waaronder ontwikkelde kracht, contractiesnelheden (+dF/dt) en ontspanning (−dF/dt), en variabiliteit van de beatsnelheid.
Dit protocol begint met instructies voor het vervaardigen van de bioreactorcomponenten. Speciale aandacht wordt besteed aan de stappen om de hECT-opbrengst te maximaliseren, de technische variabiliteit in de weefselfunctie te verminderen en de kwaliteit en diepte van de weefselbeoordeling te optimaliseren. De meeste onderzoeken naar cardiale weefselmanipulatie rapporteren geen percentages van weefselverlies tijdens fabricage en langetermijntesten, hoewel het een bekende uitdaging is in het veld en de doorvoer en efficiëntie van de onderzoeken vermindert27. De hier beschreven methoden voor weefselmanipulatie zijn in de loop der jaren verfijnd om ervoor te zorgen dat alle hECT’s in de meeste bioreactoren behouden blijven (ongeacht hoe de PDMS-rekken zijn vervaardigd). Maar zelfs een verlies van weefsels van 5%-20% kan de statistische power aanzienlijk beïnvloeden, vooral in kleinere experimenten die worden beperkt door het aantal beschikbare cardiomyocyten (bijv. als gevolg van differentiatie-uitdagingen met sommige zieke cellijnen4 of vanwege de hoge kosten van commercieel gekochte cardiomyocyten), of door de behandelingstoestand (bijv. beperkte beschikbaarheid of hoge kosten van verschillende behandelingsverbindingen).
Dit protocol beschrijft de fabricage van stabiele posttrackers (SPoT’s), een nieuwe functie van de PDMS-rekken, die fungeren als doppen aan de uiteinden van de krachtgevoelige palen die de hECTs27 bevatten. Er wordt gedemonstreerd hoe de dopgeometrie het hECT-verlies door vallen of aftrekken van de palen aanzienlijk vermindert, waardoor nieuwe mogelijkheden ontstaan voor het kweken van hECT’s met een grotere verscheidenheid aan stijfheden en spanningen, die moeilijk te kweken zijn op niet-afgedekte palen. Bovendien bieden de SPoT’s een object met een hoog contrast om de optische tracking van de hECT-contractie te verbeteren door middel van een consistente en goed gedefinieerde vorm27. Dit wordt gevolgd door een beschrijving van het kweken van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) en differentiatie van cardiomyocyten op basis van eerder gepubliceerde protocollen 3,42,43 en een uitleg van hECT-fabricage, kweek en functionele metingen.
Dit artikel gaat ook in op de noodzaak om de weefselfunctie bij fysiologische temperatuur te meten. Menselijk myocardium (zowel foetaal als volwassen gezond en ziek weefsel), evenals hartweefsel van een breed scala aan diersoorten (waaronder ratten, katten, muizen, fretten en konijnen)44,45, vertoont een duidelijke toename van de frequentie-afgestemde spiertrekkingskracht bij temperaturen van 28 °C-32 °C in vergelijking met fysiologische temperatuur – een fenomeen dat bekend staat als hypothermische inotropie45, 46. okt. De effecten van temperatuur op de functie van gemanipuleerd myocardweefsel blijven echter onderbelicht. Veel recent gemanipuleerde hartweefselmodellen in de literatuur zijn ontworpen om functioneel te worden beoordeeld bij 37 °C om fysiologische omstandigheden te benaderen 13,14,37. Voor zover wij weten, zijn de temperatuurafhankelijke effecten op de kracht die wordt gegenereerd door gemanipuleerde hartweefsels echter niet systematisch onderzocht. Dit protocol beschrijft een pacing-elektrodeontwerp dat warmteverlies tijdens het testen minimaliseert, en dat de integratie van een geïsoleerd verwarmingselement in de opstelling mogelijk maakt voor functionele metingen, waardoor de hECT’s op fysiologische temperatuur kunnen worden gehouden zonder de steriliteit in gevaar te brengen27. Vervolgens rapporteren we enkele van de waargenomen effecten van temperatuur op de hECT-functie, inclusief op de ontwikkelde kracht, spontane klopfrequentie, +dF/dt en −dF/dt. Al met al biedt dit artikel de details die nodig zijn om dit multi-weefsel krachtgevoelige bioreactorsysteem te vervaardigen om door mensen gemanipuleerde hartweefsels te fabriceren en hun contractiele functie te beoordelen, en er wordt een reeks gegevens gepresenteerd die een vergelijkingsbasis bieden voor metingen bij kamertemperatuur en bij 37 °C27.
Er zijn tal van lineair gemanipuleerde hartweefselmodellen gepubliceerd in de literatuur, waarvan sommige worden beschreven in tabel 1. Sommige modellen omvatten de directe meting van de weefselkracht, maar deze vereisen meestal het overbrengen van het construct naar een apart spierbad38. De meeste modellen zijn ontworpen met de weefsels permanent verankerd aan beide uiteinden, meestal aan PDMS-palen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 <sup cl…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs erkennen Dr. Timothy Cashman voor eerder werk aan deze methode. Deze studie werd ondersteund door financiering van de National Institutes of Health (NIH) (R01-HL132226 en K01 HL133424) en het Leducq Foundation International Networks of Excellence Program (CURE-PLaN).
0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire | McMaster Carr | 6517K61 | |
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
1.7 mL Microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
10 cm dishes (20 mm tall) | Corning | 353003 | |
10 mL Serological Pipette | Drummond | 6-000-010 | |
10 N NaOH | Fisher Scientific | SS225-1 | dilute 1:10 in sterile distilled water |
10X Modified Eagle Medium | Sigma Aldrich | M0275 | |
20 – 200 μL Micropipette | Eppendorf | 3123000055 | |
200 μL MicroPipette Tips | VWR | 76322-150 | |
5 mL Serological Pipette | Drummond | 6-000-005 | |
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
6 cm Petri Dish | Corning | 353002 | |
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator | AmScope | LED-6W | |
6-Well Plates | Corning | 353046 | |
90 degree angle mirror | Edmund Optics | 45-594 | |
Acrylic bonding glue | SCIGRIP | #4 | |
Adjustable 10 cm x 10 cm jack | Fisher Scientific | 14-673-50 | |
Aluminum 6061 | McMaster Carr | 9008K82 | |
A-Plan 10X Objective Lens | ZEISS | 1020-863 | |
Autoclave Bags | Propper | 21002 | |
B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
B-27 supplement (without insulin) | ThermoFisher | A1895601 | |
Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Black ABS | Ultimaker | 2.85 mm wide | |
Bovine Collagen I | Gibco | A1064401 | |
CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
Class II Biosafety Cabinet | Labconco | 3430009 | |
Clear Acrylic Sheeting | estreetplastics | 1002502436 | 6.25 mm thick |
CNC Vertical Mill | Haas | VF-1 | |
Conductive Graphite Bars | McMaster Carr | 1763T33 | |
Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix | ThermoFisher | 11330032 | |
Ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Dilute to 70% in water |
EVE Automated Cell counter | NanoEntek | E1000 | |
EVE Cell Counting Slide | NanoEntek | EVS-050 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10438026 | |
Fine Curved Forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation | 3110 | AKA "incubator". With HEPA class 100 filter |
Fusion360 software | Autodesk | AKA "CAD software" | |
Glass Hemocytometer | Reichert | 1475 | 0.1 mm deep |
HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
hESC qualified matrigel | Corning | 354277 | AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots |
High Speed CCD Camera | PixelLINK | P7410 | |
Inverted Microscope | Carl Zeiss Werk | Axiovert 40 CFL | 10X phase contrast objective |
IWR-1 | Selleck Chem | S7086 | |
LabView Software | National Instruments | 2016 | |
Laminar flow clean bench | NuAire | NU-201-330 | necessary for hECT functional analysis |
Laptop | AsusTek | Strix | Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM |
Laser Cutting Machine | Epilog | Helix 24 | |
Magnification headset | ExcelBlades | 70020 | Recommended for steps requiring fine manipulations |
Matlab | Mathworks | Version 2019b or later | AKA "data analysis software" |
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade | WPI Instruments | 501839 | |
Microscope Boom Stand | Olympus | SZ2-STU1 | |
Penicillin-Streptomycin stock solution | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin |
Phosphate-buffered saline without divalent cations | Sigma Aldrich | P3813 | Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations |
Pipette Controller | Drummond | 4-000-100 | |
PixelLINK Capture OEM | PixelLINK | 10.2.1.6 | AKA "Camera Software" |
Polysulfone | McMaster Carr | 86735K73 | translucent amber color |
Polytetrafluoroethylene (PTFE) | McMaster Carr | 8545K176 | Black, molded |
ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | AKA "iPSC dissociation media" |
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media | ThermoFisher | 11875135 | |
Silicone Sheeting | SMI manufacturing | glossy, 0.02 in thickness, durometer 40 | |
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads | Michael's | color should withstand autoclaving | |
Spatula | Fisher Scientific | 14-373 | used for mixing PDMS |
Square Pulse Stimulator | Astro-Med / Grass Technologies | S88X | |
Stainless Steel Razoblades | GEM | 62-0179-CTN | preferred over non-stainless steel due to lower hardness |
Stemflex | ThermoFisher | A3349401 | AKA "iPSC culture media" |
Sterile distilled water | ThermoFisher | 5230 | |
Sylgard 170 - Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit | Dow | DOWSIL 170 2LB KIT | AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS) |
Sylgard 184 – Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit | Dow | DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT | AKA Polydimethylsiloxane (PDMS) |
Temperature-controlled heated stage | Okolab | H401-HG-SMU | Set height to 10 cm |
Thermoplastic 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 3 | |
Thiazovivin | Selleck Chem | S1459 | |
Trypan Blue | NanoEntek | EBT-001 | |
Vacuum Chamber | Bel-Art Parts | F42027-0000 | |
Variable Speed Mini Band Saw | Micro-Mark | 82203 | |
Variable Speed Miniature Drill Press | Micro-Mark | 82959 | |
Vibration Isolation Table | Labconco | 3618000 | |
Weighing Boats | VWR | 10803-140 | |
Talon Cylinder Bench Clamp | VWR | 97035-528 | AKA screw clamp |