人工心臓組織のデータ取得とモデルスループットを向上させるバイオリアクターの設計
Summary
幹細胞由来の心筋細胞を用いてバイオエンジニアリングされた3次元心臓組織は、健康なヒト心筋と病気のヒト心筋を in vitro で研究するための有望なモデルとして浮上し、天然の心臓ニッチの重要な側面を再現しています。この原稿では、ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞から生成されたハイコンテント人工心臓組織を作製および分析するためのプロトコルについて説明します。
Abstract
心不全は依然として世界の主要な死因であり、ヒトの心臓のより優れた前臨床モデルが急務となっています。組織工学は、基礎科学の心臓研究に不可欠です。 in vitro でのヒト細胞培養では、動物モデルの種間の違いが排除されますが、より組織に似た3D環境(細胞外マトリックスやヘテロ細胞カップリングなど)では、プラスチック製のペトリ皿での従来の2次元培養よりもin vivo 条件をシミュレートできます。ただし、各モデルシステムには、カスタム設計のバイオリアクターや機能評価デバイスなど、特殊な機器が必要です。さらに、これらのプロトコルはしばしば複雑で労働集約的であり、小さくて繊細な組織の障害に悩まされています。
この論文では、組織機能の縦断的測定のために人工多能性幹細胞由来心筋細胞を使用して、堅牢なヒト人工心臓組織(hECT)モデルシステムを生成するプロセスについて説明します。直線的なストリップ形状の6つのhECTを並行して培養し、各hECTはPDMSラックに取り付けられた一対の力感知ポリジメチルシロキサン(PDMS)ポストから吊り下げられます。各ポストは、使いやすさ、スループット、組織保持、データ品質を向上させる新機能である黒色のPDMS安定ポストトラッカー(SPoT)で覆われています。この形状により、ポストのたわみを確実に光学的に追跡でき、絶対的な能動的および受動的張力による痙攣力の追跡が改善されます。キャップ形状により、hECTがポストから滑り落ちることによる組織障害が排除され、PDMSラック製造後の第2ステップが含まれるため、バイオリアクター製造プロセスに大きな変更を加えることなく、SPoTを既存のPDMSポストベースの設計に追加できます。
このシステムは、生理学的温度でhECT機能を測定することの重要性を実証するために使用され、データ取得中に安定した組織機能を示します。要約すると、主要な生理学的条件を再現して、 in vitro アプリケーション用に設計された心臓組織の生体忠実度、効率、および厳密性を向上させる最先端のモデルシステムについて説明します。
Introduction
人工心臓組織モデルは、従来の2次元細胞培養では実現が困難であった在来の心臓ニッチのさまざまな側面を再現するために、さまざまな形状と構成で提供されます。最も一般的な構成の1つは、組織の自己組織化を誘導し、定義されたプリロードと結果として生じるけいれん力の読み出しを組織に与えるために、両端に柔軟なアンカーを備えた線形組織ストリップです1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21
、22、23、24、25、26、27。発生する力は、組織の短縮の光学追跡と、アンカー1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11の測定されたたわみとばね定数から力を計算する弾性ビーム理論を使用して、ロバストに決定することができます。12、13、14、15、16、17、18、19、20、
21、22、25、26、28。
しかし、心臓組織工学はまだ発展途上の分野であり、いくつかの課題が残っています。カスタムメイドのバイオリアクターや機能評価装置などの専用機器は、各モデルシステム10,29,30,31に必要です。これらのコンストラクトの微小環境のサイズと複雑さは、多くの場合、労働集約的なプロトコル、多数の細胞、および組織の脆弱性による低スループットによって制限されます。これに対処するために、一部のグループは、創薬に役立つハイスループットアッセイを容易にするために、数百または数千の細胞のみを含む微小組織の作製に目を向けています。しかし、この縮小されたスケールは、機能12の正確な評価を複雑にし、本来の心臓ニッチの重要な側面(栄養素/酸素拡散勾配や複雑な構造36など)を排除し、その後の分子および構造分析に利用できる材料の量を制限します(多くの場合、組織のプールが必要です)。表1は、文献1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15における線状組織ストリップモデルの構成のいくつかを要約したものである。16、17、18、19、20、
21、22、23、24、25、26、37、38、39、40。
| 群 | 組織あたりの細胞数 | プレートあたりの組織数 | プレートフォーマット | アンカー機能 | 機能データ取得方式 | 共有メディアバス? | 機能測定- その場で? |
||||
| 吉田 (ECT)38 | 400万人 | 6 | 修正型6ウェルプレート* | 力変換器 | 直接力測定 | いいえ | いいえ | ||||
| チャン(hESC-CM-ECT)26 | 310キロメートル | 6 | カスタム6ウェルディッシュ | PDMSの投稿 | 直接力測定 | はい | いいえ | ||||
| ファインバーグ (dyn-EHT)16 | 150万人 | 6 | カスタム6ウェルディッシュ | PDMSワイヤー | 組織形状 | いいえ | はい | ||||
| RADISIC (BioWire)39, 40 | 110キロメートル競走 | 8 | ポリマーワイヤー | ワイヤー形状 | はい | はい | |||||
| 肋骨(単一のhECT)1、2 | 1-200万 | 4** | 10cmシャーレ** | PDMSの投稿 | 光学偏向(エッジ/オブジェクトトラッキング) | はい | はい | ||||
| 肋骨(multi-hECT)3–9 | 500 k-100万 | 6 | 6cmシャーレ | PDMSの投稿 | 光学偏向(エッジ/オブジェクトトラッキング) | はい | はい | ||||
| コスタ(マルチhECT W/ SPoT) | 100万人 | 6 | 6cmシャーレ | 黒いキャップのPDMSポスト | 光学偏向(オブジェクトトラッキング) | はい | はい | ||||
| パッシエ(EHT)17 | 245キロメートル | 36 | 12ウェルプレート | 黒いキャップのPDMSポスト | 光学偏向(オブジェクトトラッキング) | はい | はい | ||||
| ヴンジャク-ノヴァコビッチ13, 18 | 100万人 | 12 | 6cmシャーレ | キャップ付きPDMSポスト | 光学偏向(エッジ検出) | はい | はい | ||||
| Vunjak-Novakovic (ミリピラー)14 | 550キロメートル | 6 | カスタム6ウェルディッシュ | キャップ付きPDMSポスト | 光学偏向(物体追跡);カルシウムイメージング | いいえ | はい | ||||
| エッシェンハーゲン (EHT)10, 19–21 | 100万人 | 12 | 12ウェルプレート | キャップ付きPDMSポスト | 光学的偏向(ポストたわみのエッジ検出);カルシウムイメージング | いいえ | はい | ||||
| ザンドストラ(CaMiRi)22 | 25〜150キロメートル | 96 | 96ウェルプレート | フック付きのPDMSポスト | 光学偏向(エッジ検出) | いいえ | はい | ||||
| マリー23、24 | 900キロ | 24 | 24ウェルプレート | キャップ付きPDMSポスト、一体型マグネット | 磁気センサー | いいえ | はい | ||||
| ドイツ (μTUG)11, 12, 25 | 未定義 | 156 | 156ウェルディッシュ | キャップ付きPDMSポスト、一体型マグネット | 光学トラッキング(蛍光ビーズ) | はい | はい | ||||
表1:文献中のいくつかの線形工学心臓組織モデルの特徴。 線形工学的心臓組織モデルは、サイズ、スループット、アンカー機能の設計、共有培地浴の容易化、および機能特性評価のための個別の筋浴システムの要件が異なります。*研究者は、標準的な6ウェルプレートの寸法に基づいて、市販の人工組織システムを使用しました。** 単一組織バイオリアクターを任意のプラスチック培養皿に所望の数と位置で固定するモジュラーシステム。
この論文では、線形ヒト工学心臓組織(hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27の確立されたモデルを作製するための最新のプロトコルについて説明しますhECT収縮機能を評価する方法。各マルチティッシュバイオリアクターは、共有培地に最大6台のhECTを収容し、硬質ポリスルホンフレームに取り付けられたシリコーンエラストマーポリジメチルシロキサン(PDMS)製の2つの「ラック」ピースで構成されています。各PDMSラックには、直径0.5 mm、長さ3.25 mmの柔軟な統合型フォースセンシングポストが6つ含まれており、2つのラックには6組のポストがあり、それぞれが1つのhECTを保持します。バイオリアクターの反転は、培地からの結露や空気と液体界面のメニスカスによる歪みによる下からのhECTの可視化の障害を克服するのに役立ちます。hECTが収縮するたびに、統合されたエンドポストのたわみが発生し、たわみ信号の光学的測定は、hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27の収縮機能を表す力対時間追跡に処理されます.このサイズの組織に通常使用される単一組織バイオリアクターと比較して、マルチティッシュデザインは実験スループットを向上させ、潜在的に異なる細胞組成の隣接する組織間のパラクリンシグナル伝達の研究を可能にします。このシステムは、疾患モデリング4,8、パラクリンシグナル伝達6,7、ヘテロ細胞培養5,9、および治療スクリーニング7,9への応用を説明する発表された研究で検証されています。
このシステムでは、hECTは長さ約6mm、直径0.5mmに設計されており、低ノイズで力測定の堅牢な光学的追跡を容易にします。さらに、拡散勾配や細胞組織などの組織の複雑さの側面は、組織あたり100万個の細胞という管理可能な要件とバランスが取れています。標準的なCCDカメラ技術では、1μNという弱い力(たわみ後5μm未満を表す)で明確な信号を生成するため、一部のhECT疾患モデルで観察されるような非常に弱い収縮機能でも正確に測定できます。これにより、痙攣力曲線の詳細な分析も容易になり、したがって、発達力、収縮率(+dF/dt)および弛緩率(−dF/dt)、および拍動率変動を含む、最大16の収縮性指標41のハイコンテント分析が可能になる。
このプロトコルは、バイオリアクターコンポーネントを製造するための指示から始まります。hECT収量を最大化し、組織機能の技術的変動性を低減し、組織評価の質と深さを最適化するためのステップに特別な注意が払われています。ほとんどの心臓組織工学研究は、製造および長期検査中の組織損失率を報告していませんが、これはこの分野ではよく知られた課題であり、研究のスループットと効率を低下させます27。ここで説明する組織工学的手法は、(PDMSラックの製造方法に関係なく)ほとんどのバイオリアクターですべてのhECTを確実に保持するために、長年にわたって改良されてきました。しかしながら、組織の5%〜20%の損失でさえ、特に利用可能な心筋細胞の数によって制限される小規模な実験において(例えば、いくつかの疾患細胞株4 の分化の課題のため、または市販の心筋細胞の高コストのために)、または治療条件(例えば、様々な治療化合物の限られた入手可能性または高コスト)によって、統計的検出力に大きく影響し得る。
このプロトコルは、hECTを保持する力感知ポストの端部でキャップとして機能するPDMSラックの新機能である安定したポストトラッカー(SPoT)の製造について説明します27。キャップ形状により、ポストの落下や引き抜きによるhECTの損失が大幅に減少し、キャップのないポストでの培養が困難な、より多様な剛性と張力を持つhECTを培養するための新しい機会が開かれることが実証されています。さらに、SPoTは、一貫性のある明確に定義された形状27を通じて、hECT収縮の光学的追跡を改善するための高コントラストの物体を提供する。これに続いて、ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)の培養と、以前に発表されたプロトコル3,42,43に基づく心筋細胞の分化、およびhECTの作製、培養、および機能測定の説明が続きます。
この記事では、生理学的温度で組織機能を測定する必要性についても説明します。ヒト心筋(胎児および成人の健康および罹患組織)、および広範囲の動物種(ラット、ネコ、マウス、フェレット、ウサギを含む)の心臓組織44,45は、生理学的温度と比較して28°C-32°Cの温度で周波数整合痙攣力の著しい増加を示します-低体温異方性45として知られる現象、46。しかし、人工心筋組織機能に対する温度の影響は、まだ十分に研究されていません。文献にある最近の人工心臓組織モデルの多くは、生理学的条件を近似するために37°Cで機能的に評価されるように設計されています13,14,37。しかし、私たちの知る限り、人工心臓組織によって生成される力に対する温度依存的な影響は体系的に調査されていません。このプロトコルは、試験中の熱損失を最小限に抑え、無菌性を損なうことなくhECTを生理学的温度に維持できる機能測定用のセットアップに絶縁発熱体を組み込むことを可能にするペーシング電極設計について説明しています27。次に、発達力、自発拍数、+dF/dt、-dF/dtなど、hECT機能に観測された温度の影響のいくつかを報告します。全体として、この論文は、ヒトで操作された心臓組織を作製し、それらの収縮機能を評価するために、この多組織力感知バイオリアクターシステムを製造するために必要な詳細を提供し、室温および37°Cでの測定の比較の基礎を提供する一連のデータを提示します27。
Protocol
Representative Results
Discussion
文献には多数の線形改変心臓組織モデルが公開されており、その一部を表1に記載する。いくつかのモデルは、組織力の直接測定を含むが、これらは典型的には、構築物を別個の筋浴38に移すことを必要とする。ほとんどのモデルはPDMSのポスト1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16に両端で永久に固定されるティッシュと、最も一般的である設計…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、この方法に関する以前の研究について、Timothy Cashman博士に感謝しています。この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)(R01-HL132226およびK01 HL133424)およびLeducq Foundation International Networks of Excellence Program(CURE-PLaN)からの資金提供を受けて行われました。
Materials
| 0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire | McMaster Carr | 6517K61 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1.7 mL Microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm dishes (20 mm tall) | Corning | 353003 | |
| 10 mL Serological Pipette | Drummond | 6-000-010 | |
| 10 N NaOH | Fisher Scientific | SS225-1 | dilute 1:10 in sterile distilled water |
| 10X Modified Eagle Medium | Sigma Aldrich | M0275 | |
| 20 – 200 μL Micropipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 200 μL MicroPipette Tips | VWR | 76322-150 | |
| 5 mL Serological Pipette | Drummond | 6-000-005 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| 6 cm Petri Dish | Corning | 353002 | |
| 6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| 6-Well Plates | Corning | 353046 | |
| 90 degree angle mirror | Edmund Optics | 45-594 | |
| Acrylic bonding glue | SCIGRIP | #4 | |
| Adjustable 10 cm x 10 cm jack | Fisher Scientific | 14-673-50 | |
| Aluminum 6061 | McMaster Carr | 9008K82 | |
| A-Plan 10X Objective Lens | ZEISS | 1020-863 | |
| Autoclave Bags | Propper | 21002 | |
| B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| B-27 supplement (without insulin) | ThermoFisher | A1895601 | |
| Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Black ABS | Ultimaker | 2.85 mm wide | |
| Bovine Collagen I | Gibco | A1064401 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| Class II Biosafety Cabinet | Labconco | 3430009 | |
| Clear Acrylic Sheeting | estreetplastics | 1002502436 | 6.25 mm thick |
| CNC Vertical Mill | Haas | VF-1 | |
| Conductive Graphite Bars | McMaster Carr | 1763T33 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix | ThermoFisher | 11330032 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Dilute to 70% in water |
| EVE Automated Cell counter | NanoEntek | E1000 | |
| EVE Cell Counting Slide | NanoEntek | EVS-050 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10438026 | |
| Fine Curved Forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation | 3110 | AKA "incubator". With HEPA class 100 filter |
| Fusion360 software | Autodesk | AKA "CAD software" | |
| Glass Hemocytometer | Reichert | 1475 | 0.1 mm deep |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
| hESC qualified matrigel | Corning | 354277 | AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots |
| High Speed CCD Camera | PixelLINK | P7410 | |
| Inverted Microscope | Carl Zeiss Werk | Axiovert 40 CFL | 10X phase contrast objective |
| IWR-1 | Selleck Chem | S7086 | |
| LabView Software | National Instruments | 2016 | |
| Laminar flow clean bench | NuAire | NU-201-330 | necessary for hECT functional analysis |
| Laptop | AsusTek | Strix | Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM |
| Laser Cutting Machine | Epilog | Helix 24 | |
| Magnification headset | ExcelBlades | 70020 | Recommended for steps requiring fine manipulations |
| Matlab | Mathworks | Version 2019b or later | AKA "data analysis software" |
| Micro Vannas Scissors, 3 mm blade | WPI Instruments | 501839 | |
| Microscope Boom Stand | Olympus | SZ2-STU1 | |
| Penicillin-Streptomycin stock solution | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin |
| Phosphate-buffered saline without divalent cations | Sigma Aldrich | P3813 | Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations |
| Pipette Controller | Drummond | 4-000-100 | |
| PixelLINK Capture OEM | PixelLINK | 10.2.1.6 | AKA "Camera Software" |
| Polysulfone | McMaster Carr | 86735K73 | translucent amber color |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) | McMaster Carr | 8545K176 | Black, molded |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | AKA "iPSC dissociation media" |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media | ThermoFisher | 11875135 | |
| Silicone Sheeting | SMI manufacturing | glossy, 0.02 in thickness, durometer 40 | |
| Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads | Michael's | color should withstand autoclaving | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14-373 | used for mixing PDMS |
| Square Pulse Stimulator | Astro-Med / Grass Technologies | S88X | |
| Stainless Steel Razoblades | GEM | 62-0179-CTN | preferred over non-stainless steel due to lower hardness |
| Stemflex | ThermoFisher | A3349401 | AKA "iPSC culture media" |
| Sterile distilled water | ThermoFisher | 5230 | |
| Sylgard 170 - Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit | Dow | DOWSIL 170 2LB KIT | AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS) |
| Sylgard 184 – Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit | Dow | DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT | AKA Polydimethylsiloxane (PDMS) |
| Temperature-controlled heated stage | Okolab | H401-HG-SMU | Set height to 10 cm |
| Thermoplastic 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 3 | |
| Thiazovivin | Selleck Chem | S1459 | |
| Trypan Blue | NanoEntek | EBT-001 | |
| Vacuum Chamber | Bel-Art Parts | F42027-0000 | |
| Variable Speed Mini Band Saw | Micro-Mark | 82203 | |
| Variable Speed Miniature Drill Press | Micro-Mark | 82959 | |
| Vibration Isolation Table | Labconco | 3618000 | |
| Weighing Boats | VWR | 10803-140 | |
| Talon Cylinder Bench Clamp | VWR | 97035-528 | AKA screw clamp |
References
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