Трехмерные сердечные ткани, биоинженерные с использованием кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток, стали многообещающими моделями для изучения здорового и больного миокарда человека in vitro , повторяя ключевые аспекты нативной сердечной ниши. В данной статье описывается протокол изготовления и анализа высокосодержательных инженерных тканей сердца, полученных из индуцированных плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток человека.
Сердечная недостаточность остается основной причиной смерти во всем мире, что создает острую потребность в более совершенных доклинических моделях человеческого сердца. Тканевая инженерия имеет решающее значение для фундаментальных научных исследований в области сердца; Культура клеток человека in vitro устраняет межвидовые различия животных моделей, в то время как более тканеподобная 3D-среда (например, с внеклеточным матриксом и гетероцеллюлярным сопряжением) моделирует условия in vivo в большей степени, чем традиционная двумерная культура на пластиковых чашках Петри. Однако для каждой модельной системы требуется специализированное оборудование, например, специально разработанные биореакторы и устройства функциональной оценки. Кроме того, эти протоколы часто являются сложными, трудоемкими и страдают от отказа маленьких, нежных тканей.
В данной работе описывается процесс создания надежной системы моделирования инженерной ткани сердца человека (hECT) с использованием индуцированных плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток, для лонгитюдного измерения функции тканей. Шесть hECT с линейной геометрией полосы культивируются параллельно, при этом каждый hECT подвешивается к паре чувствительных к силе стойкам из полидиметилсилоксана (PDMS), прикрепленных к стойкам PDMS. Каждый пост увенчан черным трекером стабильных постов PDMS (SPoT), новой функцией, которая повышает простоту использования, пропускную способность, удержание тканей и качество данных. Форма позволяет надежно оптически отслеживать прогибы столбов, обеспечивая улучшенную трассировку силы подергивания с абсолютным активным и пассивным натяжением. Геометрия колпачка исключает разрушение тканей из-за соскальзывания hECT со стоек, а поскольку они включают в себя второй этап после изготовления стойки PDMS, SPoT могут быть добавлены к существующим конструкциям на основе стоек PDMS без существенных изменений в процессе изготовления биореактора.
Система используется для демонстрации важности измерения функции hECT при физиологических температурах и показывает стабильную функцию тканей во время сбора данных. Таким образом, мы описываем современную модельную систему, которая воспроизводит ключевые физиологические условия для повышения биоточности, эффективности и строгости инженерных сердечных тканей для применения in vitro .
Инженерные модели сердечной ткани имеют различную геометрию и конфигурацию для повторения различных аспектов нативной сердечной ниши, которые трудно получить с помощью традиционной двумерной клеточной культуры. Одной из наиболее распространенных конфигураций является линейная тканевая полоса с гибкими анкерами на каждом конце, чтобы вызвать самосборку ткани и обеспечить ткани определенный предварительный натяг и считывание результирующих сил подергивания 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
,22,23,24,25,26,27. Создаваемая сила может быть надежно определена с помощью оптического отслеживания укорочения ткани и использования теории упругих пучков для расчета силы на основе измеренных прогибов и постоянной пружины анкеров 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,
21,22,25,26,28.
Тем не менее, инженерия сердечных тканей все еще является развивающейся областью, и некоторые проблемы остаются. Для каждой модели системы 10,29,30,31 требуется специализированное оборудование, такое как биореакторы, изготовленные по индивидуальному заказу и устройства функциональной оценки. Размер и сложность микроокружения этих конструкций часто ограничены низкой пропускной способностью из-за трудоемких протоколов, большого количества клеток и хрупкости тканей. Чтобы решить эту проблему, некоторые группы обратились к изготовлению микротканей, содержащих только сотни или тысячи клеток, чтобы облегчить высокопроизводительные анализы, которые полезны для разработки лекарств. Однако эта уменьшенная шкала усложняет точную оценку функции12, устраняет ключевые аспекты нативной сердечной ниши (такие как градиенты диффузии питательных веществ/кислорода и сложная архитектура36) и ограничивает количество материала, доступного для последующего молекулярного и структурного анализа (часто требующего объединения тканей). В таблице 1 обобщены некоторые конфигурации линейных моделей тканевых полос в литературе 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.
Группа | Количество клеток в ткани | Количество салфеток в пластине | Формат пластины | Функция привязки | Функциональный метод сбора данных | Общая медиа-ванна? | Функциональная мера- В то же время, если вы не знаете, как это сделать, вы можете |
||||
Йошида (ECT)38 | 4 миллиона | 6 | модифицированная 6-луночная пластина* | Преобразователь силы | Прямое измерение силы | Нет | Нет | ||||
Чан (чЭСК-КМ-ЭСТ)26 | 310 К | 6 | Изготовленная на заказ тарелка с 6 лунками | Посты PDMS | Прямое измерение силы | да | Нет | ||||
Файнберг (dyn-EHT)16 | 1,5 млн чел. | 6 | Изготовленная на заказ тарелка с 6 лунками | Провод PDMS | Форма ткани | Нет | да | ||||
РАДИСИК (BioWire)39, 40 | 110 К | 8 | полимерная проволока | Форма проволоки | да | да | |||||
Коста (однократная чЭСТ)1, 2 | 1-2млн | 4** | Чашка Петри 10 см** | Посты PDMS | Оптическое отклонение (слежение за краем/объектом) | да | да | ||||
Коста (мульти-чЭСТ)3–9 | 500 К-1 миллион | 6 | Чашка Петри 6 см | Посты PDMS | Оптическое отклонение (слежение за краем/объектом) | да | да | ||||
Коста (мульти-ЭСТ с СПоТ) | 1 миллион | 6 | Чашка Петри 6 см | Столбы PDMS с черными шапками | оптическое отклонение (слежение за объектом) | да | да | ||||
Passier (EHT)17 | 245 К | 36 | 12-луночная пластина | Столбы PDMS с черными шапками | оптическое отклонение (слежение за объектом) | да | да | ||||
Вуньяк-Новакович13, 18 | 1 миллион | 12 | Чашка Петри 6 см | Столбы PDMS с заглушками | оптическое отклонение (обнаружение края) | да | да | ||||
Вуньяк-Новакович (MilliPillar)14 | 550 К | 6 | Изготовленная на заказ тарелка с 6 лунками | Столбы PDMS с заглушками | оптическое отклонение (слежение за объектом); Визуализация кальция | Нет | да | ||||
Эшенхаген (EHT)10, 19–21 | 1 миллион | 12 | 12-луночная пластина | Столбы PDMS с заглушками | оптическое отклонение (определение края постпрогиба); Визуализация кальция | Нет | да | ||||
Зандстра (CaMiRi)22 | 25-150 К | 96 | 96-луночная пластина | Посты PDMS с хуками | оптическое отклонение (обнаружение края) | Нет | да | ||||
Марри23, 24 | 900 К | 24 | 24-луночный планшет | Стойки PDMS с заглушками, встроенный магнит | Магнитный датчик | Нет | да | ||||
Рейх (мкТУГ)11, 12, 25 | неопределенный | 156 | Блюдо на 156 лунок | Стойки PDMS с заглушками, встроенный магнит | оптическое слежение (флуоресцентный шарик) | да | да |
Таблица 1: Характеристики некоторых линейно-инженерных моделей сердечной ткани в литературе. Линейно-инженерные модели сердечной ткани различаются по размеру, пропускной способности, конструкции элементов закрепления и облегчению использования ванн с общей средой, а также по требованиям к отдельной системе мышечных ванн для функциональной характеристики. * Исследователи использовали коммерчески доступную инженерную тканевую систему, основанную на размерах стандартной 6-луночной пластины. ** Модульная система, в которой однотканевые биореакторы крепятся к любой пластиковой чашке для культур в нужном количестве и месте.
В этой статье описывается новейший протокол для создания нашей установленной модели линейной инженерной сердечной ткани человека (hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 методы оценки сократительной функции hECT. Каждый многотканевой биореактор вмещает до шести hECT в общей ванне среды и состоит из двух «стоек» из силиконового эластомера полидиметилсилоксана (PDMS), установленного на жесткой раме из полисульфона. Каждая стойка PDMS содержит шесть гибких интегрированных стоек с датчиком силы диаметром 0,5 мм и длиной 3,25 мм, а вместе две стойки обеспечивают шесть пар стоек, каждая из которых вмещает один hECT. Инверсия биореактора помогает преодолеть любые препятствия для визуализации hECT снизу из-за конденсации воды из питательной среды или искажений от мениска границы раздела воздух-жидкость. Каждое сжатие hECT вызывает отклонение встроенных концевых стоек, и оптическое измерение сигнала отклонения обрабатывается в трассировку зависимости силы от времени, представляющую сократительную функцию hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . По сравнению с однотканевыми биореакторами, обычно используемыми для тканей такого размера, многотканевая конструкция повышает производительность эксперимента и позволяет изучать паракринную передачу сигналов между соседними тканями потенциально различного клеточного состава. Эта система была подтверждена в опубликованных исследованиях, описывающих применение в моделировании заболеваний 4,8, паракринной сигнализации 6,7, гетероклеточной культуре 5,9 и терапевтическом скрининге 7,9.
В этой системе hECT имеют длину около 6 мм и диаметр 0,5 мм, что обеспечивает надежное оптическое отслеживание измерений силы с низким уровнем шума. Кроме того, аспекты сложности тканей, такие как градиенты диффузии и клеточная организация, уравновешиваются управляемой потребностью в 1 миллион клеток на ткань. При использовании стандартной технологии ПЗС-камеры силы до 1 мкН (что соответствует менее 5 мкм после отклонения) генерируют четкий сигнал, гарантируя, что даже очень слабая сократительная функция, наблюдаемая в некоторых моделях заболевания hECT, может быть точно измерена. Это также облегчает детальный анализ кривой силы подергивания, что позволяет проводить анализ с высоким содержанием до 16 показателей сократимости41, включая развиваемую силу, скорости сокращения (+dF/dt) и расслабления (−dF/dt), а также вариабельность частоты биений.
Этот протокол начинается с инструкций по изготовлению компонентов биореактора. Особое внимание уделяется шагам по максимизации выхода hECT, снижению технической вариабельности функции тканей и оптимизации качества и глубины оценки тканей. В большинстве исследований в области инженерии сердечной ткани не сообщается о темпах потери тканей во время изготовления и долгосрочного тестирования, хотя это хорошо известная проблема в этой области и снижает пропускную способность иэффективность исследований. Методы тканевой инженерии, описанные здесь, совершенствовались на протяжении многих лет, чтобы обеспечить удержание всех hECT в большинстве биореакторов (независимо от того, как изготовлены стойки PDMS). Тем не менее, даже потеря 5-20% тканей может существенно повлиять на статистическую мощность, особенно в небольших экспериментах, ограниченных количеством доступных кардиомиоцитов (например, из-за проблем с дифференцировкой с некоторыми больными клеточнымилиниями или из-за высокой стоимости коммерчески закупаемых кардиомиоцитов) или условиями лечения (например, ограниченная доступность или высокая стоимость различных лекарственных препаратов).
В этом протоколе описывается изготовление стабильных пост-трекеров (SPoT), новой функции стоек PDMS, которые функционируют как колпачки на концах постов с датчиком силы, на которых размещаются hECT27. Показано, как геометрия колпачка значительно снижает потери hECT при падении или отрыве от стоек, тем самым открывая новые возможности для культивирования hECT с большим разнообразием жесткостей и напряжений, которые сложно культивировать на незакрытых стойках. Кроме того, SPoT обеспечивают высококонтрастный объект для улучшения оптического отслеживания сокращения hECT за счет последовательной и четко определенной формы27. Далее следует описание культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК) и дифференцировки кардиомиоцитов на основе ранее опубликованных протоколов 3,42,43, а также объяснение производства, культивирования и функциональных измерений hECT.
В этой статье также рассматривается необходимость измерения функции тканей при физиологической температуре. В миокарде человека (как плода, так и взрослых здоровых и больных тканей), а также в сердечной ткани широкого спектра видов животных (включая крыс, кошек, мышей, хорьков и кроликов)44,45 наблюдается заметное увеличение частотно-согласованной силы подергивания при температурах 28–32 °C по сравнению с физиологической температурой — явление, известное как гипотермическая инотропия45, 46. См. Тем не менее, влияние температуры на функцию искусственной ткани миокарда остается недостаточно изученным. Многие современные модели сердечной ткани, представленные в литературе, предназначены для функциональной оценки при 37 °C, чтобы приблизиться к физиологическим условиям 13,14,37. Однако, насколько нам известно, температурно-зависимое влияние на силу, генерируемую инженерными тканями сердца, систематически не исследовалось. В этом протоколе описывается конструкция электрода с движущейся частотой, которая сводит к минимуму потери тепла во время испытаний, а также позволяет включить изолированный нагревательный элемент в установку для функциональных измерений, который может поддерживать hECT при физиологической температуре без ущерба для стерильности27. Затем мы сообщаем о некоторых наблюдаемых эффектах температуры на функцию hECT, в том числе на развиваемую силу, частоту спонтанного биения, +dF/dt и −dF/dt. В целом, в этой статье представлены детали, необходимые для производства этой многотканевой силочувствительной биореакторной системы для изготовления инженерных тканей сердца человека и оценки их сократительной функции, а также представлен набор данных, обеспечивающих основу для сравнения измерений при комнатной температуре и при 37 °C27.
В литературе опубликовано множество линейно-инженерных моделей сердечной ткани, некоторые из которых описаны в таблице 1. Некоторые модели предполагают непосредственное измерение силы в тканях, но они, как правило, требуют переноса конструкции в отдельную мышечную ванну<sup clas…
The authors have nothing to disclose.
Авторы выражают признательность доктору Тимоти Кэшману за предыдущую работу над этим методом. Это исследование было поддержано финансированием Национальных институтов здравоохранения (NIH) (R01-HL132226 и K01 HL133424) и Международной программы передового опыта Фонда Ледюка (CURE-PLaN).
0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire | McMaster Carr | 6517K61 | |
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
1.7 mL Microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
10 cm dishes (20 mm tall) | Corning | 353003 | |
10 mL Serological Pipette | Drummond | 6-000-010 | |
10 N NaOH | Fisher Scientific | SS225-1 | dilute 1:10 in sterile distilled water |
10X Modified Eagle Medium | Sigma Aldrich | M0275 | |
20 – 200 μL Micropipette | Eppendorf | 3123000055 | |
200 μL MicroPipette Tips | VWR | 76322-150 | |
5 mL Serological Pipette | Drummond | 6-000-005 | |
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
6 cm Petri Dish | Corning | 353002 | |
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator | AmScope | LED-6W | |
6-Well Plates | Corning | 353046 | |
90 degree angle mirror | Edmund Optics | 45-594 | |
Acrylic bonding glue | SCIGRIP | #4 | |
Adjustable 10 cm x 10 cm jack | Fisher Scientific | 14-673-50 | |
Aluminum 6061 | McMaster Carr | 9008K82 | |
A-Plan 10X Objective Lens | ZEISS | 1020-863 | |
Autoclave Bags | Propper | 21002 | |
B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
B-27 supplement (without insulin) | ThermoFisher | A1895601 | |
Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Black ABS | Ultimaker | 2.85 mm wide | |
Bovine Collagen I | Gibco | A1064401 | |
CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
Class II Biosafety Cabinet | Labconco | 3430009 | |
Clear Acrylic Sheeting | estreetplastics | 1002502436 | 6.25 mm thick |
CNC Vertical Mill | Haas | VF-1 | |
Conductive Graphite Bars | McMaster Carr | 1763T33 | |
Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix | ThermoFisher | 11330032 | |
Ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Dilute to 70% in water |
EVE Automated Cell counter | NanoEntek | E1000 | |
EVE Cell Counting Slide | NanoEntek | EVS-050 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10438026 | |
Fine Curved Forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation | 3110 | AKA "incubator". With HEPA class 100 filter |
Fusion360 software | Autodesk | AKA "CAD software" | |
Glass Hemocytometer | Reichert | 1475 | 0.1 mm deep |
HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
hESC qualified matrigel | Corning | 354277 | AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots |
High Speed CCD Camera | PixelLINK | P7410 | |
Inverted Microscope | Carl Zeiss Werk | Axiovert 40 CFL | 10X phase contrast objective |
IWR-1 | Selleck Chem | S7086 | |
LabView Software | National Instruments | 2016 | |
Laminar flow clean bench | NuAire | NU-201-330 | necessary for hECT functional analysis |
Laptop | AsusTek | Strix | Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM |
Laser Cutting Machine | Epilog | Helix 24 | |
Magnification headset | ExcelBlades | 70020 | Recommended for steps requiring fine manipulations |
Matlab | Mathworks | Version 2019b or later | AKA "data analysis software" |
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade | WPI Instruments | 501839 | |
Microscope Boom Stand | Olympus | SZ2-STU1 | |
Penicillin-Streptomycin stock solution | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin |
Phosphate-buffered saline without divalent cations | Sigma Aldrich | P3813 | Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations |
Pipette Controller | Drummond | 4-000-100 | |
PixelLINK Capture OEM | PixelLINK | 10.2.1.6 | AKA "Camera Software" |
Polysulfone | McMaster Carr | 86735K73 | translucent amber color |
Polytetrafluoroethylene (PTFE) | McMaster Carr | 8545K176 | Black, molded |
ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | AKA "iPSC dissociation media" |
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media | ThermoFisher | 11875135 | |
Silicone Sheeting | SMI manufacturing | glossy, 0.02 in thickness, durometer 40 | |
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads | Michael's | color should withstand autoclaving | |
Spatula | Fisher Scientific | 14-373 | used for mixing PDMS |
Square Pulse Stimulator | Astro-Med / Grass Technologies | S88X | |
Stainless Steel Razoblades | GEM | 62-0179-CTN | preferred over non-stainless steel due to lower hardness |
Stemflex | ThermoFisher | A3349401 | AKA "iPSC culture media" |
Sterile distilled water | ThermoFisher | 5230 | |
Sylgard 170 - Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit | Dow | DOWSIL 170 2LB KIT | AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS) |
Sylgard 184 – Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit | Dow | DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT | AKA Polydimethylsiloxane (PDMS) |
Temperature-controlled heated stage | Okolab | H401-HG-SMU | Set height to 10 cm |
Thermoplastic 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 3 | |
Thiazovivin | Selleck Chem | S1459 | |
Trypan Blue | NanoEntek | EBT-001 | |
Vacuum Chamber | Bel-Art Parts | F42027-0000 | |
Variable Speed Mini Band Saw | Micro-Mark | 82203 | |
Variable Speed Miniature Drill Press | Micro-Mark | 82959 | |
Vibration Isolation Table | Labconco | 3618000 | |
Weighing Boats | VWR | 10803-140 | |
Talon Cylinder Bench Clamp | VWR | 97035-528 | AKA screw clamp |