Los tejidos cardíacos tridimensionales biodiseñados con cardiomiocitos derivados de células madre han surgido como modelos prometedores para estudiar el miocardio humano sano y enfermo in vitro , al tiempo que recapitulan aspectos clave del nicho cardíaco nativo. Este manuscrito describe un protocolo para la fabricación y el análisis de tejidos cardíacos de ingeniería de alto contenido generados a partir de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas.
La insuficiencia cardíaca sigue siendo la principal causa de muerte en todo el mundo, lo que crea una necesidad apremiante de mejores modelos preclínicos del corazón humano. La ingeniería de tejidos es crucial para la investigación cardíaca de la ciencia básica; El cultivo de células humanas in vitro elimina las diferencias entre especies de los modelos animales, mientras que un entorno 3D más parecido a un tejido (por ejemplo, con matriz extracelular y acoplamiento heterocelular) simula las condiciones in vivo en mayor medida que el cultivo bidimensional tradicional en placas de Petri de plástico. Sin embargo, cada modelo de sistema requiere equipos especializados, por ejemplo, biorreactores diseñados a medida y dispositivos de evaluación funcional. Además, estos protocolos suelen ser complicados, laboriosos y están plagados de fallos en los tejidos pequeños y delicados.
Este artículo describe un proceso para generar un sistema modelo robusto de tejido cardíaco humano (hECT) utilizando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas para la medición longitudinal de la función tisular. Se cultivan seis hECT con geometría de tira lineal en paralelo, con cada hECT suspendida de un par de postes de polidimetilsiloxano con detección de fuerza (PDMS) unidos a bastidores de PDMS. Cada publicación está cubierta con un rastreador de publicaciones estables (SPoT) PDMS negro, una nueva característica que mejora la facilidad de uso, el rendimiento, la retención de tejidos y la calidad de los datos. La forma permite el seguimiento óptico fiable de las deflexiones posteriores, lo que produce trazados mejorados de la fuerza de contracción con tensión activa y pasiva absoluta. La geometría de la tapa elimina la falla del tejido debido a que los hECT se deslizan de los postes y, como implican un segundo paso después de la fabricación del bastidor de PDMS, los SPoT se pueden agregar a los diseños existentes basados en postes de PDMS sin cambios importantes en el proceso de fabricación del biorreactor.
El sistema se utiliza para demostrar la importancia de medir la función de la TEC a temperaturas fisiológicas y muestra una función tisular estable durante la adquisición de datos. En resumen, describimos un sistema modelo de última generación que reproduce condiciones fisiológicas clave para avanzar en la biofidelidad, la eficiencia y el rigor de los tejidos cardíacos diseñados para aplicaciones in vitro .
Los modelos de tejido cardíaco diseñados vienen en una amplia gama de geometrías y configuraciones para recapitular varios aspectos del nicho cardíaco nativo que son difíciles de lograr con el cultivo celular bidimensional tradicional. Una de las configuraciones más comunes es la tira de tejido lineal, con anclajes flexibles en cada extremo para inducir el autoensamblaje del tejido y proporcionar al tejido una precarga definida y una lectura de las fuerzas de contracción resultantes 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
,22,23,24,25,26,27. La fuerza generada se puede determinar de manera robusta a través del seguimiento óptico del acortamiento del tejido y utilizando la teoría del haz elástico para calcular la fuerza a partir de las deflexiones medidas y la constante de resorte de los anclajes 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,
21,22,25,26,28.
Sin embargo, la ingeniería de tejidos cardíacos sigue siendo un campo en evolución y aún quedan algunos desafíos. Se requieren equipos especializados, como biorreactores hechos a medida y dispositivos de evaluación funcional, para cada sistema modelo 10,29,30,31. El tamaño y la complejidad del microambiente de estas construcciones a menudo están limitados por el bajo rendimiento debido a protocolos intensivos en mano de obra, alto número de células y fragilidad de los tejidos. Para abordar esto, algunos grupos han recurrido a la fabricación de microtejidos que contienen solo cientos o miles de células para facilitar ensayos de alto rendimiento que son útiles para el descubrimiento de fármacos. Sin embargo, esta escala reducida complica la evaluación precisa de la función12, elimina aspectos clave del nicho cardíaco nativo (como los gradientes de difusión de nutrientes/oxígeno y la arquitectura compleja36) y limita la cantidad de material disponible para el análisis molecular y estructural posterior (que a menudo requiere la agrupación de los tejidos). En la Tabla 1 se resumen algunas de las configuraciones de los modelos de tiras de tejido lineales en la literatura 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.
Grupo | Células por tejido | Pañuelos de papel por placa | Formato de placa | Función de anclaje | Método de adquisición de datos funcionales | ¿Baño multimedia compartido? | Medida funcional- ¿Es posible que se trate de un proceso in situ? |
||||
Yoshida (ECT)38 | 4 millones | 6 | Placa modificada de 6 pocillos* | transductor de fuerza | Medición directa de la fuerza | No | No | ||||
Chan (hESC-CM-ECTs)26 | 310 k | 6 | Plato personalizado de 6 pocillos | Publicaciones de PDMS | Medición directa de la fuerza | Sí | No | ||||
Feinberg (dyn-EHT)16 | 1,5 millones | 6 | Plato personalizado de 6 pocillos | Alambre PDMS | Forma del tejido | No | Sí | ||||
RADISIC (BioWire)39, 40 | 110 k | 8 | alambre de polímero | Forma del alambre | Sí | Sí | |||||
Costa (ECT única)1, 2 | 1-2 millones | 4** | Placa de Petri de 10 cm** | Publicaciones de PDMS | Deflexión óptica (seguimiento de bordes/objetos) | Sí | Sí | ||||
Costa (multi-hECT)3–9 | 500 K-1 millón | 6 | Placa de Petri de 6 cm | Publicaciones de PDMS | Deflexión óptica (seguimiento de bordes/objetos) | Sí | Sí | ||||
Costa (multi-hECT con SPoT) | 1 millón | 6 | Placa de Petri de 6 cm | Postes PDMS con tapas negras | Deflexión óptica (seguimiento de objetos) | Sí | Sí | ||||
Passier (EHT)17 | 245 k | 36 | Placa de 12 pocillos | Postes PDMS con tapas negras | Deflexión óptica (seguimiento de objetos) | Sí | Sí | ||||
Vunjak-Novakovic13, 18 | 1 millón | 12 | Placa de Petri de 6 cm | Postes PDMS con tapas | Deflexión óptica (detección de bordes) | Sí | Sí | ||||
Vunjak-Novakovic (MilliPillar)14 | 550 k | 6 | Plato personalizado de 6 pocillos | Postes PDMS con tapas | deflexión óptica (seguimiento de objetos); Imágenes de calcio | No | Sí | ||||
Eschenhagen (EHT)10, 19–21 | 1 millón | 12 | Placa de 12 pocillos | Postes PDMS con tapas | deflexión óptica (detección de bordes de la deflexión posterior); Imágenes de calcio | No | Sí | ||||
Zandstra (CaMiRi)22 | 25-150 k | 96 | Placa de 96 pocillos | Postes PDMS con ganchos | Deflexión óptica (detección de bordes) | No | Sí | ||||
Murry23, 24 | 900 k | 24 | Placa de 24 pocillos | Postes PDMS con tapas, imán integrado | Sensor magnético | No | Sí | ||||
Reich (μTUG)11, 12, 25 | indefinido | 156 | Plato de 156 pocillos | Postes PDMS con tapas, imán integrado | Seguimiento óptico (perla fluorescente) | Sí | Sí |
Tabla 1: Características de algunos modelos lineales de tejido cardíaco de ingeniería en la literatura. Los modelos de tejido cardíaco de ingeniería lineal varían en tamaño, rendimiento, diseños de características de anclaje y la facilitación de baños de medios compartidos, así como los requisitos de un sistema de baño muscular separado para la caracterización funcional. * Los investigadores utilizaron un sistema de tejido de ingeniería disponible comercialmente basado en las dimensiones de una placa estándar de 6 pocillos. ** Un sistema modular en el que los biorreactores de un solo tejido se anclan a cualquier placa de cultivo de plástico en el número y ubicación deseados.
Este artículo describe el protocolo más reciente para la fabricación de nuestro modelo establecido de tejido cardíaco humano lineal (hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 y métodos para evaluar la función contráctil de la TECh. Cada biorreactor multitejido tiene capacidad para hasta seis hECT en un baño de medio compartido y está compuesto por dos piezas de “rack” hechas de elastómero de silicona polidimetilsiloxano (PDMS) montadas en un marco rígido de polisulfona. Cada bastidor PDMS contiene seis postes flexibles integrados de detección de fuerza de 0,5 mm de diámetro y 3,25 mm de largo, y juntos, dos bastidores proporcionan seis pares de postes, cada uno de los cuales tiene una hECT. La inversión del biorreactor ayuda a superar cualquier obstáculo para la visualización de los hECTs desde abajo debido a la condensación de agua del medio de cultivo o a las distorsiones del menisco de la interfaz aire-líquido. Cada contracción de una hECT provoca la deflexión de los postes finales integrados, y la medición óptica de la señal de deflexión se procesa en un trazado de fuerza frente al tiempo que representa la función contráctil de la hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . En comparación con los biorreactores de un solo tejido que se utilizan normalmente para tejidos de este tamaño, el diseño multitejido mejora el rendimiento experimental y permite el estudio de la señalización paracrina entre tejidos adyacentes de composición celular potencialmente diferente. Este sistema ha sido validado en estudios publicados que describen aplicaciones en modelización de enfermedades 4,8, señalización paracrina 6,7, cultivo heterocelular 5,9 y cribado terapéutico 7,9.
En este sistema, los hECT están diseñados para tener aproximadamente 6 mm de largo y 0,5 mm de diámetro para facilitar un seguimiento óptico robusto de las mediciones de fuerza con poco ruido. Además, los aspectos de la complejidad de los tejidos, como los gradientes de difusión y la organización celular, se equilibran con un requerimiento manejable de 1 millón de células por tejido. Con la tecnología de cámara CCD estándar, fuerzas tan débiles como 1 μN (que representan menos de 5 μm después de la deflexión) generan una señal clara, lo que garantiza que incluso la función contráctil extremadamente débil, como se observa con algunos modelos de enfermedad de TEC hequimoroidal, se pueda medir con precisión. Esto también facilita el análisis detallado de la curva de fuerza de contracción, lo que permite el análisis de alto contenido de hasta 16 métricas de contractilidad41, incluida la fuerza desarrollada, las tasas de contracción (+dF/dt) y relajación (−dF/dt) y la variabilidad de la frecuencia de batido.
Este protocolo comienza con instrucciones para la fabricación de los componentes del biorreactor. Se presta especial atención a los pasos para maximizar el rendimiento de la TECH, reducir la variabilidad técnica en la función tisular y optimizar la calidad y profundidad de la evaluación tisular. La mayoría de los estudios de ingeniería de tejidos cardíacos no informan sobre las tasas de pérdida de tejido durante la fabricación y las pruebas a largo plazo, aunque es un desafío bien conocido en el campo y reduce el rendimiento y la eficiencia de los estudios27. Los métodos de ingeniería de tejidos descritos aquí se han perfeccionado a lo largo de los años para garantizar la retención de todos los hECT en la mayoría de los biorreactores (independientemente de cómo se fabriquen los racks de PDMS). Sin embargo, incluso una pérdida de tejidos del 5% al 20% puede afectar significativamente el poder estadístico, particularmente en experimentos más pequeños limitados por el número de cardiomiocitos disponibles (por ejemplo, debido a los desafíos de diferenciación con algunas líneas celulares enfermas4 o debido al alto costo de los cardiomiocitos comprados comercialmente), o por la condición del tratamiento (por ejemplo, disponibilidad limitada o alto costo de varios compuestos de tratamiento).
Este protocolo describe la fabricación de rastreadores de postes estables (SPoTs), una nueva característica de los racks PDMS, que funcionan como tapas en los extremos de los postes de detección de fuerza que sostienen los hECTs27. Se demuestra cómo la geometría de la tapa reduce significativamente la pérdida de hECT por caída o tirón de los postes, lo que abre nuevas oportunidades para el cultivo de hECT con una mayor variedad de rigideces y tensiones, que son difíciles de cultivar en postes sin tapa. Además, los SPoT proporcionan un objeto de alto contraste para mejorar el seguimiento óptico de la contracción de la TEC a través de una forma consistente y bien definida27. A continuación, se describe el cultivo de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) y la diferenciación de cardiomiocitos con base en protocolos publicados anteriormente 3,42,43 y una explicación de la fabricación, el cultivo y las mediciones funcionales de la TECH.
Este artículo también aborda la necesidad de medir la función tisular a temperatura fisiológica. El miocardio humano (tejido sano y enfermo fetal y adulto), así como el tejido cardíaco de una amplia gama de especies animales (incluidas ratas, gatos, ratones, hurones y conejos)44,45, muestra un marcado aumento en la fuerza de contracción de frecuencia a temperaturas de 28 °C-32 °C en comparación con la temperatura fisiológica, un fenómeno conocido como inotropía hipotérmica45, Artículo 46. Sin embargo, los efectos de la temperatura sobre la función tisular miocárdica modificada siguen siendo poco estudiados. Muchos modelos recientes de tejido cardíaco diseñados en la literatura están diseñados para ser evaluados funcionalmente a 37 °C para aproximarse a las condiciones fisiológicas 13,14,37. Sin embargo, hasta donde sabemos, los efectos dependientes de la temperatura sobre la fuerza generada por los tejidos cardíacos modificados no se han investigado sistemáticamente. Este protocolo describe un diseño de electrodo de estimulación que minimiza la pérdida de calor durante las pruebas, además de permitir la incorporación de un elemento calefactor aislado en la configuración para mediciones funcionales, que puede mantener los hECT a temperatura fisiológica sin comprometer la esterilidad27. A continuación, informamos de algunos de los efectos observados de la temperatura sobre la función de la TECh, incluyendo la fuerza desarrollada, la frecuencia de latido espontáneo, +dF/dt y −dF/dt. En conjunto, este artículo proporciona los detalles necesarios para fabricar este sistema de biorreactor de detección de fuerza de múltiples tejidos para fabricar tejidos cardíacos de ingeniería humana y evaluar su función contráctil, y se presenta un conjunto de datos que proporciona una base para la comparación de mediciones a temperatura ambiente y a 37 °C27.
Existen numerosos modelos de tejido cardíaco de ingeniería lineal publicados en la literatura, algunos de los cuales se describen en la Tabla 1. Algunos modelos implican la medición directa de la fuerza tisular, pero estos típicamente requieren la transferencia de la construcción a un baño muscular separado38. La mayoría de los modelos están diseñados con los tejidos anclados permanentemente en ambos extremos, más comúnmente a los postes PDMS <su…
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen al Dr. Timothy Cashman por su trabajo previo en este método. Este estudio fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) (R01-HL132226 y K01 HL133424) y el Programa de Redes Internacionales de Excelencia de la Fundación Leducq (CURE-PLaN).
0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire | McMaster Carr | 6517K61 | |
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
1.7 mL Microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
10 cm dishes (20 mm tall) | Corning | 353003 | |
10 mL Serological Pipette | Drummond | 6-000-010 | |
10 N NaOH | Fisher Scientific | SS225-1 | dilute 1:10 in sterile distilled water |
10X Modified Eagle Medium | Sigma Aldrich | M0275 | |
20 – 200 μL Micropipette | Eppendorf | 3123000055 | |
200 μL MicroPipette Tips | VWR | 76322-150 | |
5 mL Serological Pipette | Drummond | 6-000-005 | |
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
6 cm Petri Dish | Corning | 353002 | |
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator | AmScope | LED-6W | |
6-Well Plates | Corning | 353046 | |
90 degree angle mirror | Edmund Optics | 45-594 | |
Acrylic bonding glue | SCIGRIP | #4 | |
Adjustable 10 cm x 10 cm jack | Fisher Scientific | 14-673-50 | |
Aluminum 6061 | McMaster Carr | 9008K82 | |
A-Plan 10X Objective Lens | ZEISS | 1020-863 | |
Autoclave Bags | Propper | 21002 | |
B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
B-27 supplement (without insulin) | ThermoFisher | A1895601 | |
Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Black ABS | Ultimaker | 2.85 mm wide | |
Bovine Collagen I | Gibco | A1064401 | |
CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
Class II Biosafety Cabinet | Labconco | 3430009 | |
Clear Acrylic Sheeting | estreetplastics | 1002502436 | 6.25 mm thick |
CNC Vertical Mill | Haas | VF-1 | |
Conductive Graphite Bars | McMaster Carr | 1763T33 | |
Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix | ThermoFisher | 11330032 | |
Ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Dilute to 70% in water |
EVE Automated Cell counter | NanoEntek | E1000 | |
EVE Cell Counting Slide | NanoEntek | EVS-050 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10438026 | |
Fine Curved Forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation | 3110 | AKA "incubator". With HEPA class 100 filter |
Fusion360 software | Autodesk | AKA "CAD software" | |
Glass Hemocytometer | Reichert | 1475 | 0.1 mm deep |
HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
hESC qualified matrigel | Corning | 354277 | AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots |
High Speed CCD Camera | PixelLINK | P7410 | |
Inverted Microscope | Carl Zeiss Werk | Axiovert 40 CFL | 10X phase contrast objective |
IWR-1 | Selleck Chem | S7086 | |
LabView Software | National Instruments | 2016 | |
Laminar flow clean bench | NuAire | NU-201-330 | necessary for hECT functional analysis |
Laptop | AsusTek | Strix | Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM |
Laser Cutting Machine | Epilog | Helix 24 | |
Magnification headset | ExcelBlades | 70020 | Recommended for steps requiring fine manipulations |
Matlab | Mathworks | Version 2019b or later | AKA "data analysis software" |
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade | WPI Instruments | 501839 | |
Microscope Boom Stand | Olympus | SZ2-STU1 | |
Penicillin-Streptomycin stock solution | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin |
Phosphate-buffered saline without divalent cations | Sigma Aldrich | P3813 | Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations |
Pipette Controller | Drummond | 4-000-100 | |
PixelLINK Capture OEM | PixelLINK | 10.2.1.6 | AKA "Camera Software" |
Polysulfone | McMaster Carr | 86735K73 | translucent amber color |
Polytetrafluoroethylene (PTFE) | McMaster Carr | 8545K176 | Black, molded |
ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | AKA "iPSC dissociation media" |
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media | ThermoFisher | 11875135 | |
Silicone Sheeting | SMI manufacturing | glossy, 0.02 in thickness, durometer 40 | |
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads | Michael's | color should withstand autoclaving | |
Spatula | Fisher Scientific | 14-373 | used for mixing PDMS |
Square Pulse Stimulator | Astro-Med / Grass Technologies | S88X | |
Stainless Steel Razoblades | GEM | 62-0179-CTN | preferred over non-stainless steel due to lower hardness |
Stemflex | ThermoFisher | A3349401 | AKA "iPSC culture media" |
Sterile distilled water | ThermoFisher | 5230 | |
Sylgard 170 - Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit | Dow | DOWSIL 170 2LB KIT | AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS) |
Sylgard 184 – Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit | Dow | DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT | AKA Polydimethylsiloxane (PDMS) |
Temperature-controlled heated stage | Okolab | H401-HG-SMU | Set height to 10 cm |
Thermoplastic 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 3 | |
Thiazovivin | Selleck Chem | S1459 | |
Trypan Blue | NanoEntek | EBT-001 | |
Vacuum Chamber | Bel-Art Parts | F42027-0000 | |
Variable Speed Mini Band Saw | Micro-Mark | 82203 | |
Variable Speed Miniature Drill Press | Micro-Mark | 82959 | |
Vibration Isolation Table | Labconco | 3618000 | |
Weighing Boats | VWR | 10803-140 | |
Talon Cylinder Bench Clamp | VWR | 97035-528 | AKA screw clamp |