Designa en bioreaktor för att förbättra datainsamling och modellera genomströmning av konstruerad hjärtvävnad

Summary

Tredimensionell hjärtvävnad som biokonstruerats med hjälp av stamcellshärledda kardiomyocyter har dykt upp som lovande modeller för att studera friskt och sjukt humant myokardium in vitro samtidigt som man rekapitulerar viktiga aspekter av den ursprungliga hjärtnischen. Detta manuskript beskriver ett protokoll för tillverkning och analys av högteknologisk hjärtvävnad genererad från humana inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter.

Abstract

Hjärtsvikt är fortfarande den vanligaste dödsorsaken i världen, vilket skapar ett stort behov av bättre prekliniska modeller av det mänskliga hjärtat. Vävnadsteknik är avgörande för grundvetenskaplig hjärtforskning; In vitro human cellodling eliminerar skillnaderna mellan arterna i djurmodeller, medan en mer vävnadsliknande 3D-miljö (t.ex. med extracellulär matris och heterocellulär koppling) simulerar in vivo-förhållanden i större utsträckning än traditionell tvådimensionell odling på petriskålar av plast. Varje modellsystem kräver dock specialutrustning, till exempel specialdesignade bioreaktorer och funktionsbedömningsenheter. Dessutom är dessa protokoll ofta komplicerade, arbetsintensiva och plågas av att de små, ömtåliga vävnaderna misslyckas.

Denna artikel beskriver en process för att generera ett robust humant konstruerat hjärtvävnadsmodellsystem (hECT) med hjälp av inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter för longitudinell mätning av vävnadsfunktion. Sex hECT:er med linjär bandgeometri odlas parallellt, där varje hECT är upphängd i ett par kraftavkännande polydimetylsiloxanstolpar (PDMS) fästa vid PDMS-rack. Varje inlägg är täckt med en svart PDMS stabil postspårare (SPoT), en ny funktion som förbättrar användarvänligheten, genomströmningen, vävnadsretentionen och datakvaliteten. Formen möjliggör tillförlitlig optisk spårning av stolpavböjningar, vilket ger förbättrade ryckkraftsspårningar med absolut aktiv och passiv spänning. Kapsylgeometrin eliminerar vävnadsfel på grund av att hECT:er glider av stolparna, och eftersom de involverar ett andra steg efter PDMS-racktillverkning kan SPoTs läggas till befintliga PDMS-efterbaserade konstruktioner utan större förändringar i bioreaktortillverkningsprocessen.

Systemet används för att demonstrera vikten av att mäta hECT-funktionen vid fysiologiska temperaturer och visar stabil vävnadsfunktion under datainsamlingen. Sammanfattningsvis beskriver vi ett state-of-the-art modellsystem som reproducerar viktiga fysiologiska förhållanden för att främja biotrohet, effektivitet och noggrannhet hos konstruerad hjärtvävnad för in vitro-applikationer .

Introduction

Konstruerade hjärtvävnadsmodeller finns i en mängd olika geometrier och konfigurationer för att rekapitulera olika aspekter av den ursprungliga hjärtnischen som är svåra att uppnå med traditionell tvådimensionell cellodling. En av de vanligaste konfigurationerna är den linjära vävnadsremsan^, med flexibla ankare i varje ände för att inducera självorganisering av vävnaden och förse vävnaden med en definierad förspänning och en avläsning av de resulterande ryckkrafterna 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
^,22,23,24,25,26,27. Den genererade kraften kan bestämmas på ett robust sätt genom optisk spårning av vävnadsförkortningen och med hjälp av elastisk strålteori för att beräkna kraften från de uppmätta avböjningarna och fjäderkonstanten för ankarna 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11^, 12,13,14,15,16,17,18,19,20^,
21,22,25,26,28.

Hjärtvävnadsteknik är dock fortfarande ett område under utveckling, och vissa utmaningar kvarstår. Specialiserad utrustning, såsom specialtillverkade bioreaktorer och funktionsbedömningsanordningar, krävs för varje modellsystem 10,29,30,31. Storleken och komplexiteten hos mikromiljön för dessa konstruktioner begränsas ofta av låg genomströmning på grund av arbetsintensiva protokoll, ett stort antal celler och vävnadsbräcklighet. För att ta itu med detta har vissa grupper vänt sig till tillverkning av mikrovävnader som endast innehåller hundratals eller tusentals celler för att underlätta analyser med hög genomströmning som är användbara för läkemedelsupptäckt. Denna reducerade skala komplicerar dock den exakta bedömningen av funktion¹², eliminerar viktiga aspekter av den ursprungliga hjärtnischen (såsom närings-/syrediffusionsgradienter och komplex arkitektur³⁶) och begränsar mängden material som är tillgängligt för efterföljande molekylär och strukturell analys (vilket ofta kräver poolning av vävnaderna). Tabell 1 sammanfattar några av konfigurationerna av linjära vävnadsremsmodeller i litteraturen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15^, 16,17,18,19,20^,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.

Grupp		Celler per vävnad	Vävnader per platta	Plattans format		Funktion för förankring		Funktionell datainsamlingsmetod		Delat mediabad?	Funktionellt mått- på plats?
Yoshida (ECT)38		4 miljoner	6	Modifierad 6-hålsplatta*		Kraftgivare		Direkt kraftmätning		Nej	Nej
Chan (hESC-CM-ECT)26		310 k-lopp	6	anpassad 6-brunns maträtt		PDMS-inlägg		Direkt kraftmätning		Ja	Nej
Feinberg (dyn-EHT)16		1,5 miljoner	6	anpassad 6-brunns maträtt		PDMS-kabel		vävnadens form		Nej	Ja
RADISIC (BioWire)39, 40		110 km-lopp	8			Tråd av polymer		Trådens form		Ja	Ja
Costa (enkel hECT)1, 2		1-2 miljoner	4**	10 cm petriskål**		PDMS-inlägg		Optisk avböjning (kant-/objektspårning)		Ja	Ja
Costa (multi-hECT)3–9		500 K-1 miljon	6	6 cm petriskål		PDMS-inlägg		Optisk avböjning (kant-/objektspårning)		Ja	Ja
Costa (multi-hECT med SPoT)		1 miljon	6	6 cm petriskål		PDMS-stolpar med svarta lock		Optisk avböjning (objektspårning)		Ja	Ja
Passier (EHT)17		245 k-lopp	36	Tallrik med 12 brunnar		PDMS-stolpar med svarta lock		Optisk avböjning (objektspårning)		Ja	Ja
Vunjak-Novakovic13, 18		1 miljon	12	6 cm petriskål		PDMS-stolpar med lock		Optisk avböjning (kantdetektering)		Ja	Ja
Vunjak-Novakovic (MilliPillar)14		550 km-lopp	6	anpassad 6-brunns maträtt		PDMS-stolpar med lock		optisk avböjning (objektspårning); Kalcium avbildning		Nej	Ja
Eschenhagen (EHT)10, 19–21		1 miljon	12	Tallrik med 12 brunnar		PDMS-stolpar med lock		optisk avböjning (kantdetektering av efterböjning); Kalcium avbildning		Nej	Ja
Zandstra (CaMiRi)22		25-150 km-lopp	96	Platta med 96 brunnar		PDMS-stolpar med krokar		Optisk avböjning (kantdetektering)		Nej	Ja
Murry23, 24		900 km-lopp	24	Tallrik med 24 brunnar		PDMS-stolpar med lock, integrerad magnet		Magnetisk sensor		Nej	Ja
Reich (μTUG)11, 12, 25		odefinierad	156	Skål med 156 brunnar		PDMS-stolpar med lock, integrerad magnet		Optisk spårning (fluorescerande pärla)		Ja	Ja

Tabell 1: Karakteristika för några linjärt konstruerade hjärtvävnadsmodeller i litteraturen. Linjärt konstruerade hjärtvävnadsmodeller varierar i storlek, genomströmning, förankringsfunktionsdesign och underlättande av delade mediumbad, samt kraven på ett separat muskelbadsystem för funktionell karakterisering. * Forskarna använde ett kommersiellt tillgängligt konstruerat vävnadssystem baserat på måtten på en standard 6-hålsplatta. ** Ett modulärt system där bioreaktorer med en enda vävnad förankras i valfri plastodlingsskål i önskat antal och på önskad plats.

Denna artikel beskriver det senaste protokollet för tillverkning av vår etablerade modell av linjär humaniserad hjärtvävnad (hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 och metoder för att bedöma hECT:s kontraktila funktion. Varje bioreaktor med flera vävnader rymmer upp till sex hECT:er i ett gemensamt mediumbad och består av två “rack”-bitar gjorda av silikonelastomeren polydimetylsiloxan (PDMS) monterad på en styv polysulfonram. Varje PDMS-rack innehåller sex flexibla integrerade kraftavkännande stolpar som är 0,5 mm i diameter och 3,25 mm långa, och tillsammans ger två rack sex par stolpar, som var och en rymmer en hECT. Inversion av bioreaktorn hjälper till att övervinna eventuella hinder för visualisering av hECT:erna underifrån på grund av vattenkondensation från odlingsmediet eller distorsioner från menisken i luft-vätskegränssnittet. Varje sammandragning av en hECT orsakar avböjning av de integrerade ändstolparna, och den optiska mätningen av avböjningssignalen bearbetas till en kraft- kontra tidsspårning som representerar hECT:s sammandragningsfunktion 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . Jämfört med de bioreaktorer med en enda vävnad som vanligtvis används för vävnader av denna storlek, förbättrar designen med flera vävnader den experimentella genomströmningen och möjliggör studier av parakrin signalering mellan intilliggande vävnader med potentiellt olika cellulär sammansättning. Detta system har validerats i publicerade studier som beskriver tillämpningar inom sjukdomsmodellering ^4,8, parakrin signalering ^6,7, heterocellulär odling ^5,9 och terapeutisk screening ^7,9.

I detta system är hECT:erna utformade för att vara cirka 6 mm långa och 0,5 mm i diameter för att underlätta robust optisk spårning av kraftmätningar med lågt brus. Dessutom balanseras aspekter av vävnadskomplexitet såsom diffusionsgradienter och cellulär organisation med ett hanterbart behov av 1 miljon celler per vävnad. Med standard CCD-kamerateknik genererar krafter så svaga som 1 μN (vilket motsvarar mindre än 5 μm efterböjning) en tydlig signal, vilket säkerställer att även extremt svag kontraktil funktion, som observerats med vissa hECT-sjukdomsmodeller, kan mätas exakt. Detta underlättar också den detaljerade analysen av ryckkraftskurvan, vilket möjliggör analys med högt innehåll av upp till 16 kontraktilitetsmått⁴¹, inklusive utvecklad kraft, kontraktionshastigheter (+dF/dt) och relaxation (−dF/dt) och variationsfrekvens i svävningshastigheten.

Detta protokoll börjar med instruktioner för tillverkning av bioreaktorkomponenterna. Särskild uppmärksamhet ägnas åt stegen för att maximera hECT-utbytet, minska den tekniska variationen i vävnadsfunktionen och optimera kvaliteten och djupet i vävnadsbedömningen. De flesta studier av hjärtvävnadsteknik rapporterar inte vävnadsförlust under tillverkning och långtidstestning, även om det är en välkänd utmaning inom området och^{minskar genomströmningen} och effektiviteten i studierna. De vävnadstekniska metoder som beskrivs här har förfinats under årens lopp för att säkerställa retention av alla hECT:er i de flesta bioreaktorer (oavsett hur PDMS-racken är tillverkade). Men även en förlust av vävnader på 5–20 % kan avsevärt påverka den statistiska styrkan, särskilt i mindre experiment som begränsas av antalet tillgängliga kardiomyocyter (t.ex. på grund av differentieringsutmaningar med vissa sjuka cellinjer⁴ eller på grund av den höga kostnaden för kommersiellt inköpta kardiomyocyter), eller av behandlingstillståndet (t.ex. begränsad tillgänglighet eller höga kostnader för olika behandlingsföreningar).

Detta protokoll beskriver tillverkningen av stabila postspårare (SPoTs), en ny funktion i PDMS-racken, som fungerar som lock i ändarna av de kraftavkännande stolparna som håller hECTs²⁷. Det demonstreras hur lockets geometri avsevärt minskar hECT-förlusten från att falla eller dra av stolparna, vilket öppnar nya möjligheter för att odla hECT med en större variation av styvheter och spänningar, vilket är utmanande att odla på otäckta stolpar. Dessutom ger SPoTs ett objekt med hög kontrast för att förbättra den optiska spårningen av hECT-kontraktionen genom en konsekvent och väldefinierad form²⁷. Detta följs av en beskrivning av odling av humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) och kardiomyocytdifferentiering baserat på tidigare publicerade protokoll ^3,42,43 och en förklaring av hECT-tillverkning, odling och funktionella mätningar.

Den här artikeln tar också upp behovet av att mäta vävnadsfunktion vid fysiologisk temperatur. Humant myokardium (frisk och sjuk vävnad hos foster och vuxna) samt hjärtvävnad från ett brett spektrum av djurarter (inklusive råttor, katter, möss, illrar och kaniner)^44,45, uppvisar en markant ökning av den frekvensmatchade ryckkraften vid temperaturer på 28 °C–32 °C jämfört med fysiologisk temperatur – ett fenomen som kallas hypotermisk inotropi^{45. 46}. veckor Effekterna av temperatur på den konstruerade myokardvävnadens funktion är dock fortfarande understuderade. Många nyare konstruerade hjärtvävnadsmodeller i litteraturen är utformade för att bedömas funktionellt vid 37 °C för att approximera fysiologiska förhållanden 13,14,37. Såvitt vi vet har dock de temperaturberoende effekterna på den kraft som genereras av konstruerad hjärtvävnad inte undersökts systematiskt. Detta protokoll beskriver en stimuleringselektroddesign som minimerar värmeförlusten under testningen, samt möjliggör införlivande av ett isolerat värmeelement i installationen för funktionella mätningar, vilket kan hålla hECT:erna vid fysiologisk temperatur utan att kompromissa med steriliteten²⁷. Vi rapporterar sedan några av de observerade effekterna av temperatur på hECT-funktionen, inklusive på den utvecklade kraften, spontan slagfrekvens, +dF/dt och −dF/dt. Sammantaget ger denna artikel de detaljer som krävs för att tillverka detta kraftavkännande bioreaktorsystem för att tillverka mänsklig hjärtvävnad och för att bedöma deras kontraktila funktion, och en uppsättning data presenteras som ger en grund för jämförelse för mätningar vid rumstemperatur och vid 37 °C²⁷.

Protocol

Detta protokoll använde en avidentifierad iPSC-linje, SkiPS 31.3 (ursprungligen omprogrammerad med hjälp av dermala fibroblaster från en frisk 45-årig man)47, och var därför undantagen från specifikt godkännande från Institutional Review Board, i enlighet med institutionens riktlinjer för humanforskningsetiska kommittéer. Utför all cell- och hECT-manipulation under aseptiska förhållanden i ett HEPA-filtrerat biologiskt säkerhetsskåp av klass II eller arbetsbänk med laminärt flöd…

Representative Results

Enligt ovanstående protokoll genererades kardiomyocyter från en frisk iPSC-linje som tidigare använts av vår grupp 9,15 och tillverkades till hECT efter 8-61 dagar i odling. Figur 9A visar representativa bilder av hECT:er sedda nedifrån, som skapades utan (överst) och med (nederst) SPoTs. Funktionella mätningar gjordes vid rumstemperatur (23 °C) och vid fysiologisk temperatur (36 °C) mellan 37 dagar och 52 dagar efter hECT-t…

Discussion

Det finns ett stort antal linjärt konstruerade hjärtvävnadsmodeller publicerade i litteraturen, av vilka några beskrivs i tabell 1. Vissa modeller involverar direkt mätning av vävnadskraften, men dessa kräver vanligtvis att konstruktionen överförs till ett separat muskelbad³⁸. De flesta modeller är utformade med vävnaderna permanent förankrade i båda ändar, oftast till PDMS-stolpar 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 <sup class="…

Materials

0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire	McMaster Carr	6517K61
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.7 mL Microtubes	Axygen	MCT-175-C
10 cm dishes (20 mm tall)	Corning	353003
10 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-010
10 N NaOH	Fisher Scientific	SS225-1	dilute 1:10 in sterile distilled water
10X Modified Eagle Medium	Sigma Aldrich	M0275
20 – 200 μL Micropipette	Eppendorf	3123000055
200 μL MicroPipette Tips	VWR	76322-150
5 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-005
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Falcon	352070
6 cm Petri Dish	Corning	353002
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator	AmScope	LED-6W
6-Well Plates	Corning	353046
90 degree angle mirror	Edmund Optics	45-594
Acrylic bonding glue	SCIGRIP	#4
Adjustable 10 cm x 10 cm jack	Fisher Scientific	14-673-50
Aluminum 6061	McMaster Carr	9008K82
A-Plan 10X Objective Lens	ZEISS	1020-863
Autoclave Bags	Propper	21002
B-27 supplement	ThermoFisher	17504044
B-27 supplement (without insulin)	ThermoFisher	A1895601
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Black ABS	Ultimaker		2.85 mm wide
Bovine Collagen I	Gibco	A1064401
CHIR99021	Tocris	4423
Class II Biosafety Cabinet	Labconco	3430009
Clear Acrylic Sheeting	estreetplastics	1002502436	6.25 mm thick
CNC Vertical Mill	Haas	VF-1
Conductive Graphite Bars	McMaster Carr	1763T33
Dissection microscope	Olympus	SZ61
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11330032
Ethanol	Fisher Scientific	A4094	Dilute to 70% in water
EVE Automated Cell counter	NanoEntek	E1000
EVE Cell Counting Slide	NanoEntek	EVS-050
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10438026
Fine Curved Forceps	Fine Science Tools	11253-25
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Electron Corporation	3110	AKA "incubator". With HEPA class 100 filter
Fusion360 software	Autodesk		AKA "CAD software"
Glass Hemocytometer	Reichert	1475	0.1 mm deep
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
hESC qualified matrigel	Corning	354277	AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots
High Speed CCD Camera	PixelLINK	P7410
Inverted Microscope	Carl Zeiss Werk	Axiovert 40 CFL	10X phase contrast objective
IWR-1	Selleck Chem	S7086
LabView Software	National Instruments	2016
Laminar flow clean bench	NuAire	NU-201-330	necessary for hECT functional analysis
Laptop	AsusTek	Strix	Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM
Laser Cutting Machine	Epilog	Helix 24
Magnification headset	ExcelBlades	70020	Recommended for steps requiring fine manipulations
Matlab	Mathworks	Version 2019b or later	AKA "data analysis software"
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade	WPI Instruments	501839
Microscope Boom Stand	Olympus	SZ2-STU1
Penicillin-Streptomycin stock solution	ThermoFisher	15140122	10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin
Phosphate-buffered saline without divalent cations	Sigma Aldrich	P3813	Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations
Pipette Controller	Drummond	4-000-100
PixelLINK Capture OEM	PixelLINK	10.2.1.6	AKA "Camera Software"
Polysulfone	McMaster Carr	86735K73	translucent amber color
Polytetrafluoroethylene (PTFE)	McMaster Carr	8545K176	Black, molded
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872	AKA "iPSC dissociation media"
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media	ThermoFisher	11875135
Silicone Sheeting	SMI manufacturing		glossy, 0.02 in thickness, durometer 40
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads	Michael's		color should withstand autoclaving
Spatula	Fisher Scientific	14-373	used for mixing PDMS
Square Pulse Stimulator	Astro-Med / Grass Technologies	S88X
Stainless Steel Razoblades	GEM	62-0179-CTN	preferred over non-stainless steel due to lower hardness
Stemflex	ThermoFisher	A3349401	AKA "iPSC culture media"
Sterile distilled water	ThermoFisher	5230
Sylgard 170 -  Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit	Dow	DOWSIL 170 2LB KIT	AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS)
Sylgard 184 – Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit	Dow	DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT	AKA Polydimethylsiloxane (PDMS)
Temperature-controlled heated stage	Okolab	H401-HG-SMU	Set height to 10 cm
Thermoplastic 3D printer	Ultimaker	Ultimaker 3
Thiazovivin	Selleck Chem	S1459
Trypan Blue	NanoEntek	EBT-001
Vacuum Chamber	Bel-Art Parts	F42027-0000
Variable Speed Mini Band Saw	Micro-Mark	82203
Variable Speed Miniature Drill Press	Micro-Mark	82959
Vibration Isolation Table	Labconco	3618000
Weighing Boats	VWR	10803-140
Talon Cylinder Bench Clamp	VWR	97035-528	AKA screw clamp