I tessuti cardiaci tridimensionali bioingegnerizzati utilizzando cardiomiociti derivati da cellule staminali sono emersi come modelli promettenti per lo studio in vitro del miocardio umano sano e malato, ricapitolando gli aspetti chiave della nicchia cardiaca nativa. Questo manoscritto descrive un protocollo per la fabbricazione e l’analisi di tessuti cardiaci ingegnerizzati ad alto contenuto generati da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane.
L’insufficienza cardiaca rimane la principale causa di morte in tutto il mondo, creando un urgente bisogno di migliori modelli preclinici del cuore umano. L’ingegneria tissutale è fondamentale per la ricerca cardiologica di base; La coltura cellulare umana in vitro elimina le differenze interspecie dei modelli animali, mentre un ambiente 3D più simile a quello dei tessuti (ad esempio, con matrice extracellulare e accoppiamento eterocellulare) simula le condizioni in vivo in misura maggiore rispetto alla tradizionale coltura bidimensionale su piastre di Petri di plastica. Tuttavia, ogni sistema modello richiede attrezzature specializzate, ad esempio bioreattori progettati su misura e dispositivi di valutazione funzionale. Inoltre, questi protocolli sono spesso complicati, laboriosi e afflitti dal fallimento dei piccoli e delicati tessuti.
Questo articolo descrive un processo per la generazione di un robusto sistema modello di tessuto cardiaco ingegnerizzato umano (hECT) utilizzando cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte per la misurazione longitudinale della funzione tissutale. Sei hECT con geometria a striscia lineare vengono coltivati in parallelo, con ogni hECT sospeso da una coppia di perni in polidimetilsilossano (PDMS) con rilevamento della forza collegati ai rack PDMS. Ogni post è dotato di un PDMS stable post tracker (SPoT) nero, una nuova funzionalità che migliora la facilità d’uso, la produttività, la ritenzione dei tessuti e la qualità dei dati. La forma consente un tracciamento ottico affidabile delle deflessioni dei perni, ottenendo un migliore tracciamento della forza di contrazione con tensione attiva e passiva assoluta. La geometria del cappuccio elimina il cedimento del tessuto dovuto agli hECT che scivolano dai perni e, poiché comportano una seconda fase dopo la fabbricazione del rack PDMS, gli SPoT possono essere aggiunti ai progetti basati su post-post PDMS esistenti senza modifiche sostanziali al processo di fabbricazione del bioreattore.
Il sistema viene utilizzato per dimostrare l’importanza di misurare la funzione dell’hECT a temperature fisiologiche e mostra una funzione tissutale stabile durante l’acquisizione dei dati. In sintesi, descriviamo un sistema modello all’avanguardia che riproduce le condizioni fisiologiche chiave per far progredire la biofedeltà, l’efficienza e il rigore dei tessuti cardiaci ingegnerizzati per applicazioni in vitro .
I modelli ingegnerizzati di tessuto cardiaco sono disponibili in una vasta gamma di geometrie e configurazioni per ricapitolare vari aspetti della nicchia cardiaca nativa che sono difficili da ottenere con la tradizionale coltura cellulare bidimensionale. Una delle configurazioni più comuni è la striscia di tessuto lineare, con ancoraggi flessibili a ciascuna estremità per indurre l’autoassemblaggio del tessuto e fornire al tessuto un precarico definito e una lettura delle forze di contrazione risultanti 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
,22,23,24,25,26,27. La forza generata può essere determinata in modo robusto attraverso l’inseguimento ottico dell’accorciamento del tessuto e utilizzando la teoria del fascio elastico per calcolare la forza dalle deflessioni misurate e la costante elastica degli ancoraggi 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,
21,22,25,26,28.
Tuttavia, l’ingegneria dei tessuti cardiaci è ancora un campo in evoluzione e permangono alcune sfide. Per ogni modello di sistema 10,29,30,31 sono necessarie attrezzature specializzate, come bioreattori su misura e dispositivi di valutazione funzionale. Le dimensioni e la complessità del microambiente di questi costrutti sono spesso limitate da un basso rendimento dovuto a protocolli ad alta intensità di lavoro, dall’elevato numero di cellule e dalla fragilità dei tessuti. Per affrontare questo problema, alcuni gruppi si sono rivolti alla fabbricazione di microtessuti contenenti solo centinaia o migliaia di cellule per facilitare saggi ad alto rendimento utili per la scoperta di farmaci. Tuttavia, questa scala ridotta complica la valutazione accurata della funzione12, elimina aspetti chiave della nicchia cardiaca nativa (come i gradienti di diffusione di nutrienti/ossigeno e l’architettura complessa36) e limita la quantità di materiale disponibile per le successive analisi molecolari e strutturali (spesso richiedendo il pooling dei tessuti). La Tabella 1 riassume alcune delle configurazioni dei modelli di strisce di tessuto lineare in letteratura 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.
Gruppo | Cellule per tessuto | Fazzoletti per piastra | Formato piastra | Funzione di ancoraggio | Metodo di acquisizione dei dati funzionali | Bagno multimediale condiviso? | Misura funzionale- mento in situ? |
||||
Yoshida (ECT)38 | 4 milioni | 6 | Piastra a 6 pozzetti modificata* | trasduttore di forza | Misurazione diretta della forza | No | No | ||||
Chan (hESC-CM-ECTs)26 | 310 mila | 6 | Piatto personalizzato a 6 pozzetti | Posti PDMS | Misurazione diretta della forza | Sì | No | ||||
Feinberg (dyn-EHT)16 | 1,5 milioni | 6 | Piatto personalizzato a 6 pozzetti | Filo PDMS | forma del tessuto | No | Sì | ||||
RADISIC (BioWire)39, 40 | 110 mila | 8 | filo polimerico | Forma del filo | Sì | Sì | |||||
Costa (hECT singolo)1, 2 | 1-2 milioni | 4** | Piastra Petri da 10 cm** | Posti PDMS | Deflessione ottica (tracciamento di bordi/oggetti) | Sì | Sì | ||||
Costa (multi-hECT)3–9 | 500 k-1 milione | 6 | Piastra di Petri da 6 cm | Posti PDMS | Deflessione ottica (tracciamento di bordi/oggetti) | Sì | Sì | ||||
Costa (multi-hECT con SPoT) | 1 milione | 6 | Piastra di Petri da 6 cm | Pali PDMS con cappucci neri | Deflessione ottica (tracciamento dell’oggetto) | Sì | Sì | ||||
Passier (EHT)17 | 245 mila | 36 | Piastra a 12 pozzetti | Pali PDMS con cappucci neri | Deflessione ottica (tracciamento dell’oggetto) | Sì | Sì | ||||
Vunjak-Novakovic13, 18 | 1 milione | 12 | Piastra di Petri da 6 cm | Pali PDMS con tappi | deflessione ottica (rilevamento dei bordi) | Sì | Sì | ||||
Vunjak-Novakovic (MilliPilastro)14 | 550 mila | 6 | Piatto personalizzato a 6 pozzetti | Pali PDMS con tappi | deflessione ottica (tracciamento di oggetti); Imaging del calcio | No | Sì | ||||
Eschenhagen (EHT)10, 19–21 | 1 milione | 12 | Piastra a 12 pozzetti | Pali PDMS con tappi | deflessione ottica (rilevamento del bordo della post-deflessione); Imaging del calcio | No | Sì | ||||
Zandstra (CaMiRi)22 | 25-150 mila | 96 | Piastra a 96 pozzetti | Pali PDMS con ganci | deflessione ottica (rilevamento dei bordi) | No | Sì | ||||
Murry23, 24 | 900 mila | 24 | Piastra a 24 pozzetti | Pali PDMS con tappi, magnete integrato | sensore magnetico | No | Sì | ||||
Reich (μTUG)11, 12, 25 | indefinito | 156 | Piatto da 156 pozzetti | Pali PDMS con tappi, magnete integrato | Tracciamento ottico (perlina fluorescente) | Sì | Sì |
Tabella 1: Caratteristiche di alcuni modelli di tessuto cardiaco ingegnerizzato lineare in letteratura. I modelli lineari di tessuto cardiaco ingegnerizzato variano in termini di dimensioni, produttività, design delle caratteristiche di ancoraggio e facilitazione di bagni di terreno condivisi, nonché i requisiti per un sistema di bagno muscolare separato per la caratterizzazione funzionale. * I ricercatori hanno utilizzato un sistema tissutale ingegnerizzato disponibile in commercio basato sulle dimensioni di una piastra standard a 6 pozzetti. ** Un sistema modulare in cui i bioreattori monotissutale sono ancorati a qualsiasi piastra di coltura in plastica nel numero e nella posizione desiderati.
Questo documento descrive l’ultimo protocollo per la fabbricazione del nostro modello consolidato di tessuto cardiaco lineare ingegnerizzato umano (hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 e metodi per la valutazione della funzione contrattile dell’eCT. Ogni bioreattore multi-tessuto ospita fino a sei hECT in un bagno di terreno condiviso ed è composto da due pezzi “rack” realizzati con l’elastomero siliconico polidimetilsilossano (PDMS) montato su un telaio rigido in polisulfone. Ogni rack PDMS contiene sei montanti flessibili integrati con rilevamento della forza di 0,5 mm di diametro e 3,25 mm di lunghezza e, insieme, due rack forniscono sei coppie di montanti, ognuno dei quali contiene un hECT. L’inversione del bioreattore aiuta a superare qualsiasi ostacolo alla visualizzazione degli hECT dal basso dovuto alla condensazione dell’acqua dal terreno di coltura o alle distorsioni del menisco dell’interfaccia aria-liquido. Ogni contrazione di un hECT provoca la deflessione dei pali terminali integrati e la misurazione ottica del segnale di deflessione viene elaborata in un tracciato della forza rispetto al tempo che rappresenta la funzione contrattile dell’hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . Rispetto ai bioreattori monotissutali tipicamente utilizzati per tessuti di queste dimensioni, il design multi-tessuto migliora la produttività sperimentale e consente lo studio della segnalazione paracrina tra tessuti adiacenti di composizione cellulare potenzialmente diversa. Questo sistema è stato validato in studi pubblicati che descrivono applicazioni nella modellazione della malattia 4,8, nella segnalazione paracrina 6,7, nella coltura eterocellulare 5,9 e nello screening terapeutico 7,9.
In questo sistema, gli hECT sono progettati per essere lunghi circa 6 mm e con un diametro di 0,5 mm per facilitare un robusto tracciamento ottico delle misurazioni della forza con basso rumore. Inoltre, aspetti della complessità tissutale, come i gradienti di diffusione e l’organizzazione cellulare, sono bilanciati con un fabbisogno gestibile di 1 milione di cellule per tessuto. Con la tecnologia standard delle telecamere CCD, forze deboli come 1 μN (che rappresentano meno di 5 μm di post-deflessione) generano un segnale chiaro, assicurando che anche la funzione contrattile estremamente debole, come osservato con alcuni modelli di malattia hECT, possa essere misurata con precisione. Ciò facilita anche l’analisi dettagliata della curva della forza di contrazione, consentendo così l’analisi ad alto contenuto di un massimo di 16 metriche di contrattilità41, tra cui la forza sviluppata, i tassi di contrazione (+dF/dt) e di rilassamento (−dF/dt) e la variabilità della frequenza di battimento.
Questo protocollo inizia con le istruzioni per la fabbricazione dei componenti del bioreattore. Particolare attenzione è rivolta alle fasi per massimizzare la resa di hECT, ridurre la variabilità tecnica nella funzione tissutale e ottimizzare la qualità e la profondità della valutazione tissutale. La maggior parte degli studi di ingegneria tissutale cardiaca non riporta i tassi di perdita di tessuto durante la fabbricazione e i test a lungo termine, sebbene sia una sfida ben nota nel campo e riduca la produttività e l’efficienza degli studi27. I metodi di ingegneria tissutale qui descritti sono stati perfezionati nel corso degli anni per garantire la ritenzione di tutti gli hECT nella maggior parte dei bioreattori (indipendentemente da come sono fabbricati i rack PDMS). Tuttavia, anche una perdita del 5%-20% dei tessuti può influenzare significativamente la potenza statistica, in particolare negli esperimenti più piccoli limitati dal numero di cardiomiociti disponibili (ad esempio, a causa di problemi di differenziazione con alcune linee cellulari malate4 o a causa dell’alto costo dei cardiomiociti acquistati in commercio), o dalle condizioni di trattamento (ad esempio, disponibilità limitata o costo elevato di vari composti di trattamento).
Questo protocollo descrive la fabbricazione di inseguitori di pali stabili (SPoT), una nuova caratteristica dei rack PDMS, che funzionano come tappi alle estremità dei pali di rilevamento della forza che contengono gli hECT27. È stato dimostrato come la geometria del cappuccio riduca significativamente la perdita di hECT dovuta alla caduta o al distacco dei montanti, aprendo così nuove opportunità per la coltivazione di hECT con una maggiore varietà di rigidità e tensioni, che sono difficili da coltivare su pali non tappati. Inoltre, gli SPoT forniscono un oggetto ad alto contrasto per migliorare l’inseguimento ottico della contrazione hECT attraverso una forma coerente e ben definita27. Segue una descrizione della coltura di cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) e del differenziamento dei cardiomiociti sulla base dei protocolli 3,42,43 pubblicati in precedenza e una spiegazione della fabbricazione, della coltura e delle misurazioni funzionali dell’hECT.
Questo articolo affronta anche la necessità di misurare la funzione dei tessuti alla temperatura fisiologica. Il miocardio umano (tessuto sano e malato fetale e adulto), così come il tessuto cardiaco di un’ampia gamma di specie animali (tra cui ratti, gatti, topi, furetti e conigli)44,45, mostra un marcato aumento della forza di contrazione abbinata alla frequenza a temperature di 28 °C-32 °C rispetto alla temperatura fisiologica, un fenomeno noto come inotropia ipotermica45, 46. Tuttavia, gli effetti della temperatura sulla funzione del tessuto miocardico ingegnerizzato rimangono poco studiati. Molti recenti modelli di tessuto cardiaco ingegnerizzato in letteratura sono progettati per essere valutati funzionalmente a 37 °C per approssimare le condizioni fisiologiche 13,14,37. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, gli effetti dipendenti dalla temperatura sulla forza generata dai tessuti cardiaci ingegnerizzati non sono stati studiati in modo sistematico. Questo protocollo descrive un design dell’elettrodo di stimolazione che riduce al minimo la perdita di calore durante il test, oltre a consentire l’incorporazione di un elemento riscaldante isolato nella configurazione per le misurazioni funzionali, in grado di mantenere gli hECT a temperatura fisiologica senza compromettere la sterilità27. Riportiamo quindi alcuni degli effetti osservati della temperatura sulla funzione dell’hECT, tra cui la forza sviluppata, la frequenza di battimento spontaneo, +dF/dt e −dF/dt. Nel complesso, questo documento fornisce i dettagli necessari per produrre questo sistema di bioreattore multi-tessuto con rilevamento della forza per fabbricare tessuti cardiaci ingegnerizzati dall’uomo e per valutare la loro funzione contrattile, e viene presentata una serie di dati che forniscono una base di confronto per le misurazioni a temperatura ambiente e a 37 °C27.
Esistono numerosi modelli di tessuto cardiaco ingegnerizzato lineare pubblicati in letteratura, alcuni dei quali sono descritti nella Tabella 1. Alcuni modelli prevedono la misurazione diretta della forza tissutale, ma in genere richiedono il trasferimento del costrutto in un bagno muscolare separato38. La maggior parte dei modelli sono progettati con i tessuti ancorati in modo permanente ad entrambe le estremità, più comunemente ai perni PDMS …
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano il Dr. Timothy Cashman per il precedente lavoro su questo metodo. Questo studio è stato sostenuto dai finanziamenti del National Institutes of Health (NIH) (R01-HL132226 e K01 HL133424) e del programma di reti internazionali di eccellenza della Fondazione Leducq (CURE-PLaN).
0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire | McMaster Carr | 6517K61 | |
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
1.7 mL Microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
10 cm dishes (20 mm tall) | Corning | 353003 | |
10 mL Serological Pipette | Drummond | 6-000-010 | |
10 N NaOH | Fisher Scientific | SS225-1 | dilute 1:10 in sterile distilled water |
10X Modified Eagle Medium | Sigma Aldrich | M0275 | |
20 – 200 μL Micropipette | Eppendorf | 3123000055 | |
200 μL MicroPipette Tips | VWR | 76322-150 | |
5 mL Serological Pipette | Drummond | 6-000-005 | |
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
6 cm Petri Dish | Corning | 353002 | |
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator | AmScope | LED-6W | |
6-Well Plates | Corning | 353046 | |
90 degree angle mirror | Edmund Optics | 45-594 | |
Acrylic bonding glue | SCIGRIP | #4 | |
Adjustable 10 cm x 10 cm jack | Fisher Scientific | 14-673-50 | |
Aluminum 6061 | McMaster Carr | 9008K82 | |
A-Plan 10X Objective Lens | ZEISS | 1020-863 | |
Autoclave Bags | Propper | 21002 | |
B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
B-27 supplement (without insulin) | ThermoFisher | A1895601 | |
Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Black ABS | Ultimaker | 2.85 mm wide | |
Bovine Collagen I | Gibco | A1064401 | |
CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
Class II Biosafety Cabinet | Labconco | 3430009 | |
Clear Acrylic Sheeting | estreetplastics | 1002502436 | 6.25 mm thick |
CNC Vertical Mill | Haas | VF-1 | |
Conductive Graphite Bars | McMaster Carr | 1763T33 | |
Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix | ThermoFisher | 11330032 | |
Ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Dilute to 70% in water |
EVE Automated Cell counter | NanoEntek | E1000 | |
EVE Cell Counting Slide | NanoEntek | EVS-050 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10438026 | |
Fine Curved Forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation | 3110 | AKA "incubator". With HEPA class 100 filter |
Fusion360 software | Autodesk | AKA "CAD software" | |
Glass Hemocytometer | Reichert | 1475 | 0.1 mm deep |
HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
hESC qualified matrigel | Corning | 354277 | AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots |
High Speed CCD Camera | PixelLINK | P7410 | |
Inverted Microscope | Carl Zeiss Werk | Axiovert 40 CFL | 10X phase contrast objective |
IWR-1 | Selleck Chem | S7086 | |
LabView Software | National Instruments | 2016 | |
Laminar flow clean bench | NuAire | NU-201-330 | necessary for hECT functional analysis |
Laptop | AsusTek | Strix | Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM |
Laser Cutting Machine | Epilog | Helix 24 | |
Magnification headset | ExcelBlades | 70020 | Recommended for steps requiring fine manipulations |
Matlab | Mathworks | Version 2019b or later | AKA "data analysis software" |
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade | WPI Instruments | 501839 | |
Microscope Boom Stand | Olympus | SZ2-STU1 | |
Penicillin-Streptomycin stock solution | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin |
Phosphate-buffered saline without divalent cations | Sigma Aldrich | P3813 | Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations |
Pipette Controller | Drummond | 4-000-100 | |
PixelLINK Capture OEM | PixelLINK | 10.2.1.6 | AKA "Camera Software" |
Polysulfone | McMaster Carr | 86735K73 | translucent amber color |
Polytetrafluoroethylene (PTFE) | McMaster Carr | 8545K176 | Black, molded |
ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | AKA "iPSC dissociation media" |
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media | ThermoFisher | 11875135 | |
Silicone Sheeting | SMI manufacturing | glossy, 0.02 in thickness, durometer 40 | |
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads | Michael's | color should withstand autoclaving | |
Spatula | Fisher Scientific | 14-373 | used for mixing PDMS |
Square Pulse Stimulator | Astro-Med / Grass Technologies | S88X | |
Stainless Steel Razoblades | GEM | 62-0179-CTN | preferred over non-stainless steel due to lower hardness |
Stemflex | ThermoFisher | A3349401 | AKA "iPSC culture media" |
Sterile distilled water | ThermoFisher | 5230 | |
Sylgard 170 - Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit | Dow | DOWSIL 170 2LB KIT | AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS) |
Sylgard 184 – Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit | Dow | DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT | AKA Polydimethylsiloxane (PDMS) |
Temperature-controlled heated stage | Okolab | H401-HG-SMU | Set height to 10 cm |
Thermoplastic 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 3 | |
Thiazovivin | Selleck Chem | S1459 | |
Trypan Blue | NanoEntek | EBT-001 | |
Vacuum Chamber | Bel-Art Parts | F42027-0000 | |
Variable Speed Mini Band Saw | Micro-Mark | 82203 | |
Variable Speed Miniature Drill Press | Micro-Mark | 82959 | |
Vibration Isolation Table | Labconco | 3618000 | |
Weighing Boats | VWR | 10803-140 | |
Talon Cylinder Bench Clamp | VWR | 97035-528 | AKA screw clamp |