Her beskriver vi en ny flowcytometrisk metode for prospektiv isolering av tidlig burst-forming unit erythroid (BFU-e) og kolonidannende enhet erythroid (CFU-e) forfedre direkte fra fersk mus benmarg og milt. Denne protokollen, utviklet basert på enkeltcellede transkriptomiske data, er den første som isolerer alle vevets erytroidprogenitorer med høy renhet.
Tidlige erytroid-forfedre ble opprinnelig definert av deres kolonidannende potensial in vitro og klassifisert i burst-forming og kolonidannende “enheter” kjent som BFU-e og CFU-e. Inntil nylig var metoder for direkte prospektiv og fullstendig isolering av rene BFU-e og CFU-e forfedre fra nyisolert voksen mus benmarg tilgjengelig. For å løse dette gapet ble et enkeltcellet RNA-seq (scRNAseq) datasett av musebenmarg analysert for ekspresjon av gener som koder for celleoverflatemarkører. Denne analysen ble kombinert med celleskjebneanalyser, noe som gjorde det mulig å utvikle en ny flowcytometrisk tilnærming som identifiserer og tillater isolering av komplette og rene undergrupper av BFU-e og CFU-e forfedre i musebenmarg eller milt. Denne tilnærmingen identifiserer også andre stamcelleundergrupper, inkludert delmengder beriket for basofil / mastcelle og megakaryocytiske potensialer. Metoden består av merking av ferske benmargs- eller miltceller med antistoffer rettet mot Kit og CD55. Forfedre som uttrykker begge disse markørene blir deretter delt inn i fem hovedpopulasjoner. Populasjon 1 (P1 eller CFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71 med/high) inneholder alle CFU-e forfedrene og kan videre deles inn i henholdsvis P1-low (CD71med CD150 high) og P1-hi (CD71 high CD150 low), tilsvarende henholdsvis tidlig og sen CFU-e; Populasjon 2 (P2 eller BFU-e, Kit + CD55+ CD49f med/lav CD105med/høy CD71lav CD150høy) inneholder alle BFU-e forfedrene; Populasjon P3 (P3, Kit + CD55+ CD49f med/høy CD105med/lav CD150 lav CD41lav) er beriket for basofile/ mastcelleprogenitorer; Populasjon 4 (P4, Kit + CD55+ CD49f med/høy CD105med/lav CD150høy CD41+) er beriket for megakaryocytiske forfedre; og populasjon 5 (P5, Kit + CD55+ CD49f med/høy CD105 med/lav CD150høy CD41–) inneholder stamcellermed erytroid, basofil/mastcelle og megakaryocytisk potensiale (EBMP) og erytroide/megakaryocyttiske/basofil-forutinntatte multipotensielle stamceller (MPP). Denne nye tilnærmingen gir større presisjon ved analyse av erytroid og andre hematopoietiske forfedre og gir også mulighet for referanse til transkriptominformasjon for hver flowcytometrisk definert populasjon.
Erytropoiesen kan deles inn i to hovedfaser: tidlig erytropoiese og erytroid terminal differensiering (figur 1)1,2,3. I tidlig erytropoiese forplikter hematopoietiske stamceller seg til erytroidlinjen og gir opphav til tidlige erytroidprogenitorer, som først ble identifisert på 1970-tallet basert på deres kolonidannende potensial i halvfast medium 4,5,6,7,8,9 . I stor grad er erytroide forfedre delt inn i to kategorier: tidligere forfedre som hver gir opphav til en “burst” (et stort aggregat av mindre erytroidcelleklynger), kalt “burst-forming unit erythroid” eller BFU-e 4,5,6; og deres avkom, som hver danner en enkelt, liten erytroidcelleklynge eller koloni, kalt “kolonidannende enhet erytroid” eller CFU-e 7,8,9. BFU-e og CFU-e uttrykker ennå ikke terminale erytroidgener og er ikke morfologisk gjenkjennelige. Etter en rekke selvfornyelses- eller ekspansjonscelledelinger gjennomgår CFU-e en transkripsjonsbryter der erytroidgener som globiner induseres, og går dermed over til erytroid terminal differensiering (ETD)1,10. Under ETD gjennomgår erytroblaster tre til fem modningscelledelinger før de enukleerer for å danne retikulocytter, som modnes til røde blodlegemer.
Erytroblaster under terminal differensiering ble opprinnelig klassifisert basert på deres morfologi i proerythroblaster, basofile, polykromatiske og ortokromatiske. Ankomsten av flowcytometri tillot deres prospektive sortering og isolasjon basert på cellestørrelse (målt ved fremoverspredning, FSC) og to celleoverflatemarkører, CD71 og Ter11911,12,13 (figur 1). Denne og lignende flowcytometriske tilnærminger14 har revolusjonert undersøkelsen av de molekylære og cellulære aspektene ved ETD, noe som tillater utviklingsstadiespesifikk analyse av erytroblaster in vivo og in vitro 10,15,16,17,18,19,20. CD71/Ter119-tilnærmingen brukes nå rutinemessig i analysen av erytroide forløpere.
Inntil nylig har en lignende, tilgjengelig flowcytometrisk tilnærming for direkte, høy renhet prospektiv isolering av CFU-e og BFU-e fra musevev unnsluppet etterforskere. I stedet har forskere brukt flowcytometriske strategier som isolerer bare en brøkdel av disse forfedrene, ofte i nærvær av ikke-erytroidceller som samrenser innenfor de samme flowcytometriske delmengdene21. Undersøkelsen av BFU-e og CFU-e var derfor begrenset til in vitro differensieringssystemer som utleder og forsterker BFU-e og CFU-e fra tidligere benmargsprogenitorer. Det er da mulig å anvende flowcytometriske strategier som skiller CFU-e fra BFU-e i disse erytroide forfedreberikede kulturene22,23. En alternativ tilnærming benytter seg av føtal CFU-e og BFU-e, som er svært beriket i Ter119-negativ fraksjon av musens fosterlever ved midten av svangerskapet 10,24,25. Ingen av disse tilnærmingene tillater imidlertid undersøkelse av voksen BFU-e og CFU-e i deres fysiologiske tilstand in vivo. Størrelsen på utfordringen kan bli verdsatt når man husker at disse cellene, basert på kolonidannelsesanalyser, er tilstede i den voksne benmargen med en frekvens på henholdsvis bare 0,025% og 0,3%, henholdsvis6.
Protokollen beskrevet her er en ny flowcytometrisk tilnærming basert på encellet transkriptomisk analyse av nyhøstede Kit + musebenmargceller (Kit uttrykkes av alle de tidlige stamcellepopulasjonene i benmargen)1. Vår tilnærming inneholder noen celleoverflatemarkører som allerede var i bruk av Pronk et al.21,26. Enkeltcelletranskriptomer ble brukt til å bestemme kombinasjoner av celleoverflatemarkører som identifiserer erytroide og andre tidlige hematopoietiske forfedre (figur 2). Nærmere bestemt kan CD55+-fraksjonen av avstamningsnegative (Lin–) Kit+-celler deles inn i fem populasjoner, hvorav tre gir sammenhengende segmenter av erytroidbanen (figur 2). De transkriptomiske identitetene til hver av disse populasjonene ble bekreftet ved sortering, etterfulgt av scRNAseq og projeksjon av de sorterte enkeltcellede transkriptomene tilbake på det opprinnelige transkriptomiske kartet (genuttrykket i hver av de fem populasjonene og hele benmargsdatasettet kan utforskes i https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . Celleskjebnepotensialet til hver av populasjonene ble bekreftet ved hjelp av tradisjonelle kolonidannelsesanalyser (figur 2), samt en ny høykapasitets enkeltcellet skjebneanalyse 1,27. Disse analysene viser at den nye flowcytometriske tilnærmingen resulterer i isolasjon med høy renhet av alle BFU-e- og CFU-e-forfedrene til ferske voksne benmarg og milt. Nærmere bestemt inneholder populasjon 1 (P1) bare CFU-e og ingen andre hematopoietiske forfedre, og populasjon 2 (P2) inneholder alle benmargens BFU-e forfedre og et lite antall CFU-e, men ingen andre forfedre1. Den detaljerte protokollen nedenfor er ytterligere illustrert med et eksempeleksperiment hos mus som ble injisert med enten saltvann eller med det erytropoiesestimulerende hormonet erytropoietin (Epo).
Evnen til prospektivt å isolere BFU-e og CFU-e forfedre direkte fra friskt vev med høy renhet hadde tidligere unnsluppet etterforskere. Vår nye tilnærming, validert ved hjelp av scRNAseq og celleskjebneanalyser 1,27, tilbyr nå verktøyene for å gjøre dette.
Det finnes en rekke viktige punkter for vellykket gjennomføring av både sorterings- og analyseprotokollene. Først må cellene spinnes ved 900 x g for å forhindre…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er støttet av NIH-stipendene R01DK130498, R01DK120639 og R01HL141402
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575020 | |
1000 µL large orifice tips | USA sceintific | 1011-9000 | |
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody | BioLegend | 131806 | |
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody | BioLegend | 105826 | |
Biotin-CD11b | BD Biosciences | 557395 | M1/70 (clone) |
Biotin-CD19 | BD Biosciences | 553784 | 1D3 (clone) |
Biotin-CD4 | BD Biosciences | BDB553045 | RM4-5 (clone) |
Biotin-CD8a | BD Biosciences | BDB553029 | 53-6.7 (clone) |
Biotin-F4/80 | Biolegend | 123106 | BM8 (clone) |
Biotin-Ly-6G and Ly-6C | BD Biosciences | 553125 | RB6-8C5 (clone) |
Biotin-TER-119 | BD Biosciences | 553672 | TER-119 (clone) |
Bovine Serum Albumin | Sigma aldritch | A1470 | |
Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313624 | |
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody | BioLegend | 133921 | |
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody | BioLegend | 115931 | |
BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells | BD Biosciences | 563827 | |
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 011-000-003 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | |
Digital DIVA hardware and software for LSR II | BD Biosciences | ||
FITC anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123108 | |
FITC Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 557396 | |
FITC Rat Anti-Mouse CD19 | BD Biosciences | 553785 | |
FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 553047 | |
FITC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553031 | |
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C | BD Biosciences | 553127 | |
FlowJo software | FlowJo | version 10 | Flow cytometer analysis software |
LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer | BD Biosciences | Flow cytometer | |
NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle Set | Amazon | ||
Normal rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
PE anti-mouse CD105 Antibody | BioLegend | 120408 | |
PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody | BioLegend | 113812 | |
Phosphate Buffered Saline, 10x Solution | Fisher scientific | BP3994 | |
Streptavidin Nanobeads | BioLegend | 480016 | Magnetic beads |