Çay Numunelerinde Pirrolizidin Alkaloid Kontaminasyonunun Kaynağı ve Yolu
Summary
Bu protokol, çay bahçelerindeki PA üreten yabani otlardan alınan çay örneklerinde pirolizidin alkaloidlerinin (PA’lar) kontaminasyonunu açıklamaktadır.
Abstract
Çay örneklerinde insan sağlığı için tehdit oluşturan toksik pirolizidin alkaloidleri (PA’lar) bulunur. Bununla birlikte, çay örneklerinde PA kontaminasyonunun kaynağı ve yolu belirsizliğini korumuştur. Bu çalışmada, Ageratum conyzoides L., A. conyzoides rizosferik toprak, taze çay yaprakları ve kurutulmuş çay örneklerinde 15 PA’yı belirlemek için UPLC-MS / MS ile birleştirilmiş bir adsorban yöntemi geliştirilmiştir . Ortalama iyileşmeler %78-%111 arasında değişirken, göreceli standart sapmalar %0,33-%14,8 arasında değişmiştir. Çin’in Anhui Eyaleti’ndeki Jinzhai çay bahçesinden on beş çift A. conyzoides ve A. conyzoides rizosferik toprak örneği ve 60 taze çay yaprağı örneği toplandı ve 15 PA için analiz edildi . Taze çay yapraklarında, intermedine-N-oksit (ImNO) ve senecionine (Sn) hariç, 15 PA’nın tümü tespit edilmemiştir. ImNO’nun (34.7 μg / kg) içeriği Sn’ninkinden (9.69 μg / kg) daha büyüktü. Ek olarak, hem ImNO hem de Sn, çay bitkisinin genç yapraklarında yoğunlaşırken, içerikleri yaşlı yapraklarda daha düşüktü. Sonuçlar, çaydaki PA’ların çay bahçelerinde PA üreten yabani otlar-toprak-taze çay yaprakları yolundan aktarıldığını göstermiştir.
Introduction
İkincil metabolitler olarak, pirolizidin alkaloidleri (PA’lar) bitkileri otoburlara, böceklere ve patojenlere karşı korur 1,2. Şimdiye kadar, dünya çapında 6.000’den fazla bitki türünde farklı yapılara sahip 660’tan fazla PA ve PA-N-oksit (PANO) bulunmuştur 3,4. PA üreten bitkiler esas olarak Asteraceae, Boraginaceae, Fabaceae ve Apocynaceae 5,6 familyalarında bulunur. PA’lar, güçlü elektrofilisiteye sahip olan ve DNA ve proteinler gibi nükleofillere saldırabilen kararsız dehidropirolizidin alkaloidlerine kolayca oksitlenir, bu da karaciğer hücresi nekrozu, venöz tıkanıklıklar, siroz, asit ve diğer semptomlarla sonuçlanır 7,8. PA toksisitesinin ana hedef organı karaciğerdir. PA’lar ayrıca akciğer, böbrek ve diğer organ toksisitesine ve mutajenik, kanserojen ve gelişimsel toksisiteye neden olabilir 9,10.
Birçok ülkede, PA içeren geleneksel bitkilerin, takviyelerin veya çayların yutulmasından veya süt, bal veya et gibi gıdaların dolaylı kontaminasyonundan (PA’lar içeren meraların yutulmasından kaynaklanan toksik) insan ve hayvan zehirlenmesi vakaları bildirilmiştir11,12,13. Avrupa Gıda Güvenliği Otoritesi (EFSA) bulguları, (bitkisel) çay gibi maddelerin, insanların PA’lara / PANO’lara maruz kalmasının önemli bir kaynağı olduğunu göstermektedir14. Çay örnekleri PA üretmezken, PA üreten bitkiler çay bahçelerinde yaygın olarak bulunur (örneğin, Emilia sonchifolia, Senecio angulatus ve Ageratum conyzoides)15. Daha önce çayın, toplama ve işleme sırasında üretim tesislerinden PA’larla kontamine olabileceğinden şüpheleniliyordu. Bununla birlikte, bazı elle toplanan çay yapraklarında da PA’lar tespit edilmiştir (yani, PA üreten bitkiler yoktur), bu da başka kirlilik yolları veya kaynakları olması gerektiğini düşündürmektedir16. Ragwort (Senecio jacobaea) ile melissa (Melissa officinalis), nane (Mentha piperita), maydanoz (Petroselinum crispum), papatya (Matricaria recutita) ve nasturtium (Tropaeolum majus) bitkileriyle birlikte yetiştirme deneyi yapıldı ve sonuçlar tüm bu bitkilerde PA’ların tespit edildiğini gösterdi17. PA’ların gerçekten de toprak yoluyla canlı bitkiler arasında aktarıldığı ve değiş tokuş edildiği doğrulanmıştır18,19. Van Wyk ve ark.20, rooibos çayının (Aspalathus linearis) yabani ot bakımından zengin bölgelerde ciddi şekilde kirlendiğini ve aynı tip ve oranda PA’lar içerdiğini bulmuşlardır. Bununla birlikte, yabancı otsuz bölgelerde rooibos çayında PA tespit edilmemiştir.
Günümüzde, yüksek seçicilik ve duyarlılığa sahip ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometresi (UPLC-MS / MS), tarım ürünleri ve gıdalardaki PA’ların kalitatif ve kantitatif analizinde yaygın olarak kullanılmaktadır21,22. Numune işleme yöntemi genellikle katı faz ekstraksiyonu (SPE) veya QuEChERS (Hızlı Kolay Ucuz Etkili Sağlam Güvenli) kompleks gıda matrisleri ekstraktlarının temizlenmesinden oluşur ve bu da mümkün olan en yüksek hassasiyeti elde edebilir12,19. Bununla birlikte, toprak, yabani otlar ve taze çay yaprakları gibi karmaşık matrislerde PA’ların tespit edilmesine ve nicelleştirilmesine izin veren sağlam analitik yöntemler hala eksiktir.
Bu çalışma, kurutulmuş çay örnekleri, taze çay yaprakları, yabani otlar ve yabancı ot rizosferik toprak örneklerinde 15 PA’yı bir adsorban saflaştırma yöntemi ile birleştirilmiş UPLC-MS / MS ile analiz etmiştir. Ayrıca, Çin’in Anhui Eyaleti’ndeki Jinzhai çay bahçesindeki beş örnekleme alanından 15 eşleştirilmiş yabani ot ve yabancı ot rizosferik toprak örneği ve 60 taze çay yaprağı örneği toplandı ve 15 PA için analiz edildi. Bu sonuçlar, çayın kalitesini ve güvenliğini sağlamak için bir anket yöntemi ve çay numunelerindeki PA’ların (kontaminasyon) kaynağı ve rotası hakkında bazı bilgiler sağlayabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, çay numunelerindeki PA’ların kontaminasyon yollarını ve kaynaklarını ve ayrıca çay bitkilerinin farklı bölgelerindeki PA’ların dağılımını araştırmak için etkili ve hassas bir yöntem geliştirmek üzere tasarlanmıştır. Bununla birlikte, bu çalışmada, kromatografik sütun üzerinde sadece 15 PA başarıyla ayrılmıştır, bu dabitki türleri 3,4’teki çok sayıda alkaloitle karşılaştırıldığında çok küçük bir say…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (32102244), Ulusal Tarım Ürünleri Kalite ve Güvenlik ve Risk Değerlendirme Projesi (GJFP2021001), Anhui Eyaleti Doğal Bilimsel Vakfı (19252002) ve USDA (HAW05020H) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Acetonitrile (99.9%) | Tedia Company,Inc. | 21115197 | CAS No:75-05-8 |
| Ammonia (25%-28%) | Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. | 181210 | CAS No:1336-21-6 |
| Ammonium formate (97.0%) | Anpel Laboratory Technoiogies (shanghai) | G0860050 | CAS No:540-69-2 |
| Carbon-GCB | CNW | B7760030 | 120-400 MESH, 10g. per box |
| Centrifuge Z 36 HK | HERMLE | Z36HK | 30000 rpm (min:10 rpm), Dimensions (W x H x D): 71.5 cm× 42 cm × 51 cm |
| Commercially available tea product | Lvming, Qingshan, Luyuchun, Changling, Huixing, Wuyunjian, Heshengchun | loose tea | Green tea |
| Europine N-oxid (EuNO) (98.0%) | BioCrick | 323256 | CAS No:65582-53-8 |
| Europine (Eu) (98.0%) | BioCrick | 98222 | CAS No:570-19-4 |
| Formate (98.0%) | Aladdin | E2022005 | CAS No:64-18-6 |
| HC-C18 | CNW | D2110060 | 40-63 μm,100g.per box |
| Heliotrine (He) (98.0%) | BioCrick | 906426 | CAS No:303-33-3 |
| Heliotrine-N-oxide (HeNO) (98.0%) | BioCrick | 22581 | CAS No:6209-65-0 |
| High speed centrifuge TG16-WS | cence | 203158000 | Max:16000 r/min, 330 × 390 × 300 mm (L × W × H), Capacity: 6 × 50 mL |
| HSS T3 column | Waters | 186004976 | ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 × 100 mm 1.8 μm) |
| Intermedine (Im) (98.0%) | BioCrick | 114843 | CAS No:10285-06-0 |
| Intermedine-N-oxide (ImNO) (98.0%) | BioCrick | 340066 | CAS No:95462-14-9 |
| Jacobine (Jb) (98.0%) | BioCrick | 132282048 | CAS No:6870-67-3 |
| Jacobine-N-oxide (JbNO) (98.0%) | ChemFaces | CFN00461 | CAS No:38710-25-7 |
| Methyl Alcohol (99.9%) | Tedia Company,Inc. | 21115100 | CAS No:67-56-1 |
| PSA | Agela | P19-00833 | 40-60 μm, 60 Å 100g.per box |
| Retrorsine (Re) (98.0%) | BioCrick | 5281743 | CAS No:480-54-6 |
| Retrorsine-N-oxide (ReNO) (98.0%) | BioCrick | 5281734 | CAS No:15503-86-3 |
| Senecionine (Sc) (98.0%) | BioCrick | 5280906 | CAS No:130-01-8 |
| Senecionine-N-oxide (ScNO) (98.0%) | BioCrick | 5380876 | CAS No:13268-67-2 |
| Seneciphylline N-oxid (SpNO) (98.0%) | BioCrick | 6442619 | CAS No:38710-26-8 |
| Seneciphylline (Sp) (98.0%) | BioCrick | 5281750 | CAS No:480-81-9 |
| Senkirkine (Sk) (98.0%) | BioCrick | 5281752 | CAS No:2318-18-5 |
| SPE PCX | Agilent Technologies | 12108206 | Cation Mixed Mode, 6 mL |
| Sulfuric acid (97%) | Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. | 1003019 | CAS No:7664-93-9 |
| Trisodium citrate | Sinpharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20121009 | CAS No:6132-04-3 |
| Ultrasonic cleaner | Supmile | KQ-600B | Inner slot size: 500 × 300 × 150 mm; Capacity: 22.5 L |
| UPLC-xevoTQMS | Waters | ZPLYY-003 | Triple four-stage rod mass analyzer, Waters Alliance 2695/Waters ACQUITY UPLC Liquid Phase System |
| Water bath thermostat oscillator | Guoyu instrument | SHY-2AHS | Oscillation times: 60-300 times/min, Constant temperature range: room temperature to 100 °C |
References
- Schramm, S., Kohler, N., Rozhon, W. Pyrrolizidine alkaloids: Biosynthesis, biological activities and occurrence in crop plants. Molecules. 24 (3), 498 (2019).
- EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). Scientific opinion on pyrrolizidine alkaloids in food and feed. EFSA Journal. 9 (11), 134 (2011).
- Ma, C., et al. Determination and regulation of hepatotoxic pyrrolizidine alkaloids in food: A critical review of recent research. Food and Chemical Toxicology. 119, 50-60 (2018).
- Keuth, O., Humpf, H. U., Fürst, P., Melton, L., Shahidi, F., Varelis, P. Pyrrolizidine Alkaloids: Analytical Challenges. Encyclopedia of Food Chemistry. 1, 348-355 (2019).
- Huang, D. Y., et al. Pyrrolizidine alkaloids and its source analysis in tea. Journal of Food Safety & Quality. 9 (2), 229-236 (2018).
- Liang, A. H., Ye, Z. G. General situation of the toxicity researches on Senecio. China Journal of Chinese Materia Medica. 31 (2), 93-97 (2006).
- Li, Y. H., et al. Proteomic study of pyrrolizidine alkaloid-induced hepatic sinusoidal obstruction syndrome in rats. Chemical Research in Toxicology. 28 (9), 1715-1727 (2015).
- Jia, Z. J., et al. Catalytic enantioselective synthesis of a pyrrolizidine-alkaloid-inspired compound collection with antiplasmodial activity. The Journal of Organic Chemistry. 83, 7033-7041 (2018).
- Yang, M., et al. First evidence of pyrrolizidine alkaloid N-oxide-induced hepatic sinusoidal obstruction syndrome in humans. Archives of Toxicology. 91 (12), 3913-3925 (2017).
- Chen, Z., Huo, J. R. Hepatic veno-occlusive disease associated with toxicity of pyrrolizidine alkaloids in herbal preparations. Netherlands Journal of Medicine. 68 (6), 252-260 (2010).
- Mattocks, A. R. . Chemistry and Toxicology of Pyrrolizidine Alkaloid. , (1986).
- Picron, J. F., Herman, M., Van Hoeck, E., Goscinny, S. Analytical strategies for the determination of pyrrolizidine alkaloids in plant based food and examination of the transfer rate during the infusion process. Food Chemistry. 266, 514-523 (2018).
- Kowalczyk, E., Kwiatek, K. Application of the sum parameter method for the determination of pyrrolizidine alkaloids in teas. Food Additives & Contaminants: Part A. 37 (4), 622-633 (2020).
- EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). Risks for human health related to the presence of pyrrolizidine alkaloids in honey, tea, herbal infusions and food supplements. EFSA Journal. 15 (7), 04908 (2017).
- Han, H., et al. Pyrrolizidine alkaloids in tea: A review of analytical methods, contamination levels and health risk. Food Science. 42 (17), 255-266 (2021).
- Nowak, M., et al. Interspecific transfer of pyrrolizidine alkaloids: An unconsidered source of contaminations of phytopharmaceuticals and plant derived commodities. Food Chemistry. 213, 163-168 (2016).
- Selmar, D., et al. Transfer of pyrrolizidine alkaloids between living plants: A disregarded source of contaminations. Environmental Pollution. 248, 456-461 (2019).
- Izcara, S., et al. Miniaturized and modified QuEChERS method with mesostructured silica as clean-up sorbent for pyrrolizidine alkaloids determination in aromatic herbs. Food Chemistry. 380, 132189 (2022).
- Izcara, S., Casado, N., Morante-Zarcero, S., Sierra, I. A miniaturized QuEChERS method combined with ultrahigh liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry for the analysis of pyrrolizidine alkaloids in oregano samples. Foods. 9 (9), 1319 (2020).
- Van Wyk, B. E., Stander, M. A., Long, H. S. Senecio angustifolius as the major source of pyrrolizidine alkaloid contamination of rooibos tea (Aspalathus linearis). South African Journal of Botany. 110, 124-131 (2017).
- Johnson, A. E., Molyneux, R. J., Merrill, G. B. Chemistry of toxic range plants. Variation in pyrrolizidine alkaloid content of Senecio, Amsinckia, and Crotalaria species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 33 (1), 50-55 (1985).
- Vrieling, K., de Vos, H., van Wijk, C. A. M. Genetic analysis of the concentrations of pyrrolizidine alkaloids in Senecio jacobaea. Phytochemistry. 32 (5), 1141-1144 (1993).
- Han, H. L., et al. Development, optimization, validation and application of ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry for the analysis of pyrrolizidine alkaloids and pyrrolizidine alkaloid N-oxides in teas and weeds. Food control. 132, 108518 (2022).
- Bodi, D., et al. Determination of pyrrolizidine alkaloids in tea, herbal drugs and honey. Food Additives & Contaminants: Part A. 31 (11), 1886-1895 (2014).
- European Union Commission. Commission Regulation (EU) 2020/2040 of 11 December 2020 amending Regulation (EC) No 1881/2006 as regards maximum levels of pyrrolizidine alkaloids in certain foodstuffs. Official Journal of the European Union. 14 (12), 1-4 (2020).
