בעבודה זו, גישה של בנייה מחדש במבחנה משמשת לחקר הפורואלסטיות של ג’ל אקטומיוזין בתנאים מבוקרים. הדינמיקה של ג’ל האקטומיוזין והממס המוטבע מכומתים, שבאמצעותם מודגמת פורואלסטיות הרשת. אנו דנים גם באתגרים הניסיוניים, במלכודות הנפוצות וברלוונטיות למכניקת השלד התא.
תאים יכולים לשנות באופן פעיל את צורתם ולהפוך לתנועתיים, תכונה התלויה ביכולתם לארגן מחדש באופן פעיל את המבנה הפנימי שלהם. תכונה זו מיוחסת לתכונות המכניות והדינמיות של שלד התא, בעיקר שלד האקטומיוזין (actomyosin cytoskeleton), שהוא ג’ל פעיל של חוטי אקטין קוטביים, מנועי מיוזין וחלבוני עזר בעלי תכונות כיווץ פנימיות. הדעה המקובלת היא ששלד הציטו-שלד מתנהג כחומר ויסקו-אלסטי. עם זאת, מודל זה אינו יכול תמיד להסביר את תוצאות הניסוי, אשר עקביות יותר עם תמונה המתארת את השלד הציטו-אלסטי כחומר פעיל פורואלסטי – רשת אלסטית המשובצת בציטוזול. שיפועי התכווצות הנוצרים על ידי מנועי המיוזין מניעים את זרימת הציטוזול על פני נקבוביות הג’ל, מה שמסיק שהמכניקה של שלד הציטו-שלד והציטוזול צמודים זה לזה. אחד המאפיינים העיקריים של פורואלסטיות הוא הרפיה דיפוזית של לחצים ברשת, המאופיינת בקבוע דיפוזיה יעיל התלוי במודולוס האלסטי של הג’ל, בנקבוביות ובצמיגות הציטוזול (ממס). מכיוון שלתאים יש דרכים רבות לווסת את המבנה שלהם ואת תכונות החומר שלהם, ההבנה הנוכחית שלנו לגבי האופן שבו מכניקת השלד הציטו-שלד ודינמיקת זרימת הציטוזול מצומדים עדיין אינה מובנת. כאן, גישה של בנייה מחדש במבחנה משמשת כדי לאפיין את התכונות החומריות של ג’ל אקטומיוזין פורואלסטי כמערכת מודל עבור שלד התא. התכווצות הג’ל מונעת על ידי התכווצות מנוע מיוזין, מה שמוביל להופעת זרימה של הממס החודר. המאמר מתאר כיצד להכין את הג’לים האלה ולערוך ניסויים. כמו כן, אנו דנים כיצד למדוד ולנתח את זרימת הממס והתכווצות הג’ל הן ברמה המקומית והן ברמה העולמית. יחסי קנה המידה השונים המשמשים לכימות נתונים ניתנים. לבסוף, נדונים אתגרי הניסוי והמלכודות הנפוצות, כולל הרלוונטיות שלהם למכניקת השלד התא.
לתאים חיים יש תכונות מכניות ייחודיות. מלבד היכולת להגיב באופן פסיבי לכוחות יישומיים, הם מסוגלים גם לייצר כוחות באופן פעיל בתגובה לגירויים חיצוניים1. מאפיינים אלה, החיוניים למגוון תהליכים תאיים, בעיקר במהלך תנועתיות התא, מיוחסים בעיקר לתכונות המכניות והדינמיות של שלד התא, במיוחד שלד התא, שהוא ג’ל פעיל של חוטי אקטין קוטביים, מנועים מולקולריים מיוזין וחלבונים נלווים. רשתות אקטומיוזין אלה מציגות תכונות ארגון עצמי והתכווצות מהותיות המונעות על ידי חלבונים מוטוריים מיוזין, אשר מצליבים את חוטי האקטין ויוצרים באופן פעיל לחצים מכניים ברשת המונעת על ידי הידרוליזה ATP2.
מחקרים ניסיוניים ותיאורטיים רבים נערכו כדי לחקור את התכונות החומריות של שלדציטו-שלד 3. הדעה המקובלת היא ששלד הציטו-שלד מתנהג כחומר ויסקו-אלסטי4. משמעות הדבר היא כי בטווחי זמן קצרים, שלד הציטו-שלד מתנהג כחומר אלסטי, ובטווחי זמן ארוכים, הוא מתנהג כנוזל צמיגי עקב החלבונים הצולבים והניתוק המוטורי של מיוזין (וחיבור מחדש), המאפשר לרשת להתחלף באופן דינמי. עם זאת, במצבים רבים, המודל הוויסקו-אלסטי אינו יכול לתאר את תוצאות הניסוי, אשר תואמות יותר לתמונה המתארת את השלד הציטו-אלסטי, ובאופן כללי יותר, הציטופלסמה של התא המתוארת כחומר פעיל פורואלסטי 5,6. שני מאפיינים עיקריים מאפיינים סוגים אלה של חומרים. (i) התכונה העיקרית הראשונה היא יצירת זרימה של הציטוזול החודר (“הממס”) על פני נקבוביות הג’ל על ידי שיפועי התכווצות המונעים על ידי מנועי המיוזין, העומדים בבסיס תהליכים כגון בלימת תאים7, תנועתיות8 ותנודות בצורת תא9. הופעתם של זרמים ציטוסוליים כאלה יכולה להיות מקומית, עבור blebbing, או גלובלית, כמו בתנועתיות התא. במקרה האחרון, הלחצים המופעלים על ידי התכווצות בחלק האחורי של התא מניעים את זרימת הנוזל הציטוסולי לכיוון חזית התא, אשר מחדש את מאגר החלבונים הדרוש להרכבת למליפודיה8. (ii) התכונה העיקרית השנייה היא שהרפיית הלחצים היא דיפוזית ומאופיינת בקבוע דיפוזיה יעיל, , התלוי במודולוס האלסטי של הג’ל, נקבוביות הג’ל וצמיגות הממס5. קבוע הדיפוזיה הפורואלסטי קובע כמה מהר המערכת מגיבה ללחץ מופעל. קבועי דיפוזיה גבוהים יותר מתאימים לחלוקה מחדש מהירה יותר של מתח. זה, בתורו, קובע כמה זמן לוקח לנוזל הציטוסולי התוך-תאי להיות מופץ מחדש בתוך התא בעקבות לחץ מכני מופעל, בין אם הוא חיצוני או פנימי, כגון הלחצים התכווצות הפעילים הנוצרים על ידי מנועי מיוזין. דוגמאות אלה, אם כן, מראות כי המכניקה של השלד והציטוזול מצומדים זה לזה באופן הדוק ולא ניתן לטפל בהם בנפרד3.
מכיוון שתאים יכולים לווסת את התכונות המכניות שלהם במגוון דרכים, יחסי הגומלין בין מכניקת הרשת ודינמיקת זרימת הנוזלים עדיין אינם מובנים. גישה חלופית רבת עוצמה היא להשתמש במערכות משוחזרות במבחנה המאפשרות שליטה מלאה במרכיבים המיקרוסקופיים השונים ובפרמטרים של המערכת, מה שהופך את מערכות המודל הללו לאופטימליות לניתוח פיזיקלי10,11. גישה זו יושמה בהצלחה כדי לחקור את ההשפעה של הרכב חלבונים וגיאומטריה של המערכת על תנועתיות מבוססת אקטין 12,13,14,15,16,17,18, דפוס דו-ממדי של רשתות אקטומיוזין 19,20,21,22ויחסי הגומלין בין התכווצות הרשת לבין דינמיקת זרימת הנוזלים של ג’לים אקטומיוזינים פורואלסטיים, העומדים במוקד מאמר זה23.,
בכתב יד זה, הכנת רשתות אקטומיוזין אלסטיות מתכווצות של ממדים ניתנים לשליטה ותכונות חומריות נדונה בהתבסס על עבודתם של Ideses et al.23. הדינמיקה של הג’ל המתכווץ והממס המנוקז מנותחים ומכומתים, שבאמצעותם הוכח כי ניתן לתאר ג’לים אקטומיוזינים אלה כחומר פעיל פורואלסטי. חקר ההשפעה של צמיגות ממס על דיפוזיביות מתח מאשר עוד יותר את האופי הפורובלסטי של רשתות אלה. יחסי קנה המידה השונים המשמשים לכימות נתונים מסופקים. לבסוף, נדונים גם אתגרי הניסוי, המלכודות הנפוצות, והרלוונטיות של תוצאות הניסוי לשלד התא.
כאן, גישה במבחנה משמשת כדי לאפיין את המכניקה של ג’ל אקטומיוזין פורואלסטי כמערכת מודל של שלד התא, ובאופן כללי יותר, של הציטופלסמה של התא, אשר הוכח להתנהג כחומר פורואלסטי 3,5. הריאולוגיה של שלד התא (ציטופלסמה) מאופיינת בקבוע דיפוזיה פורואלסטי, המכתיב כמה זמ?…
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות לדינה ארנוביץ על טיהור ותיוג החלבון. ג.ל. מודה למשרד המדע, הטכנולוגיה והחלל על מלגת ז’בוטינסקי לדוקטורט. א.ב.ג. מודה לקרן הלאומית למדע (מענק 2101/20) ולמשרד המדע והטכנולוגיה – מדינת ישראל (מענק 3-17491) על התמיכה הכספית.
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane | Sigma-Aldrich Company | 175617 | Stored under Argon atmosphere at 4 °C |
Acetic acid | Bio-Lab ltd | 1070521 | |
Alexa-Fluor 488 | Invitrogene | A10254 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
Alexa-Fluor 647 | Invitrogene | A20347 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
BSA | Sigma -Aldrich Company | A3059 | Stored at 4 °C |
Catalase | Sigma -Aldrich Company | C9322 | The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C |
Coverslips | Mezel-glaser | CG2222-1.5 | Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks |
Creatine kinase | Roche Life Science Products | 10736988001 | Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days. The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C |
Creatine phosphate | Roche Life Science Products | 10621714001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C |
DTT | Roche Life Science Products | 10708984001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months |
Dual view Simultaneous Imaging System | Photometrics | DV2-CUBE | |
EGTA | MP Biomedicals | 195174 | |
EM-CCD Camera | Andor Technology Ltd | DV 887 | |
EM-CCD Camera | Photometrics | Evolve Delta | |
Ethanol | Bio-Lab ltd | 525050300 | |
Flourescence Lamp | Rapp Optoelectronic | ||
Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences | 17151-10 | 200 nm diameter |
Glucose | ICN Biomedicals Inc | 194024 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. |
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich Company | G7141 | Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C |
Glycerol | ICN Biomedicals Inc | 800687 | |
Glycine | MP Biomedicals | 808822 | |
Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich Company | 216763 | Stored at 4 °C |
KCl | EMD Millipore Corp. | 529552 | |
Methanol | Bio-Lab ltd | 1368052100 | |
MgCl2 | EMD Millipore Corp. | 442615 | |
Microscope | Leica Microsystems | DMI3000 | |
mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-5k | Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C |
Nile red microspheres | Spherotech | FP-2056-2 | 2300 nm diameter |
Objective (10x) | Leica Germany | HC PL AP0 | UPlanFL Numerical Aperture = 0.3 |
Objective (2.5x) | Leica Germany | 506304 | Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075 |
Oven | WTC Binder | ||
Parafilm | Amcor | PM-996 | |
PBS Buffer | Sigma-Aldrich Company | P4417 | |
Shutter Driver | Vincet Associates | VMM D1 | |
Silica gel | Merck | 1.01907.5000 | |
Sonicator | Elma | Elmasonic P | |
Sulfuric acid | Carlo Erba reagents | 410301 | |
DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System | Photometrics | ||
TRIS | MP Biomedicals | 819620 | |
UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia | Ultraspec 2100 pro | |
MICROMAN E | Gilson | FD10001 | 1–10 uL |
MATLAB R2017b | MathWorks | Data quantification | |
MetaMorph | Molecular devices | Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size) |