I dette arbejde anvendes en in vitro rekonstitutionsmetode til at studere poroelasticiteten af actomyosingeler under kontrollerede forhold. Dynamikken i actomyosingelen og det indlejrede opløsningsmiddel kvantificeres, hvorigennem netværksporoelasticiteten demonstreres. Vi diskuterer også de eksperimentelle udfordringer, almindelige faldgruber og relevans for cellecytoskeletmekanik.
Celler kan aktivt ændre deres former og blive bevægelige, en egenskab, der afhænger af deres evne til aktivt at omorganisere deres interne struktur. Denne funktion tilskrives de mekaniske og dynamiske egenskaber ved cellecytoskelettet, især actomyosincytoskelettet, som er en aktiv gel af polære actinfilamenter, myosinmotorer og tilbehørsproteiner, der udviser iboende sammentrækningsegenskaber. Den normalt accepterede opfattelse er, at cytoskelettet opfører sig som et viskoelastisk materiale. Denne model kan dog ikke altid forklare de eksperimentelle resultater, som er mere konsistente med et billede, der beskriver cytoskelettet som et poroelastisk aktivt materiale – et elastisk netværk indlejret med cytosol. Kontraktilitetsgradienter genereret af myosinmotorerne driver cytosolens strømning over gelporerne, hvilket udleder, at cytoskeletets og cytosolens mekanik er tæt koblet. Et hovedtræk ved poroelasticitet er den diffusive afslapning af spændinger i netværket, kendetegnet ved en effektiv diffusionskonstant, der afhænger af gelelastisk modul, porøsitet og cytosol (opløsningsmiddel) viskositet. Da celler har mange måder at regulere deres struktur og materialeegenskaber på, er vores nuværende forståelse af, hvordan cytoskeletmekanik og cytosolstrømningsdynamik er koblet, stadig dårligt forstået. Her anvendes en in vitro rekonstitutionsmetode til at karakterisere materialeegenskaberne af poroelastiske actomyosingeler som et modelsystem for cellecytoskelettet. Gelkontraktion drives af myosinmotorkontraktilitet, hvilket fører til fremkomsten af en strøm af det gennemtrængende opløsningsmiddel. Papiret beskriver, hvordan man forbereder disse geler og kører eksperimenter. Vi diskuterer også, hvordan man måler og analyserer opløsningsmiddelflowet og gelkontraktionen både på lokal og global skala. De forskellige skaleringsrelationer, der anvendes til datakvantificering, er angivet. Endelig diskuteres de eksperimentelle udfordringer og almindelige faldgruber, herunder deres relevans for cellecytoskeletmekanik.
Levende celler har unikke mekaniske egenskaber. Udover evnen til passivt at reagere på anvendte kræfter er de også i stand til aktivt at generere kræfter som reaktion på eksterne stimuli1. Disse egenskaber, som er afgørende for en række cellulære processer, især under cellemotilitet, tilskrives primært de mekaniske og dynamiske egenskaber af cellecytoskelettet, især actomyosincytoskelettet, som er en aktiv gel af polære actinfilamenter, myosinmolekylære motorer og tilbehørsproteiner. Disse actomyosin-netværk udviser iboende selvorganiserings- og sammentrækningsegenskaber drevet af myosinmotorproteinerne, som tværbinder actinfilamenterne og aktivt genererer mekaniske belastninger i netværket, der drives af ATP-hydrolyse2.
Talrige eksperimentelle og teoretiske undersøgelser er blevet udført for at studere cytoskeletets materielle egenskaber3. Den almindeligt accepterede opfattelse er, at cytoskelettet opfører sig som et viskoelastisk materiale4. Dette betyder, at cytoskelettet på korte tidsskalaer opfører sig som et elastisk materiale, og på lange tidsskalaer opfører det sig som en viskøs væske på grund af tværbindingsproteinerne og myosinmotorisk løsrivelse (og genvedhæftning), hvilket gør det muligt for netværket dynamisk at turnover. I mange situationer kan den viskoelastiske model imidlertid ikke beskrive de eksperimentelle resultater, som er mere konsistente med et billede, der beskriver cytoskelettet og mere generelt cellecytoplasmaet, der beskrives som et poroelastisk aktivt materiale 5,6. To hovedtræk karakteriserer disse typer materialer. (i) Det første hovedtræk er dannelsen af en strøm af den gennemtrængende cytosol (“opløsningsmidlet”) over gelporerne ved kontraktilitetsgradienter drevet af myosinmotorerne, som ligger til grund for processer som celleblegning7, motilitet8 og celleformoscillationer9. Fremkomsten af sådanne cytosoliske strømme kan være lokal, til blødning eller global, som i cellemotilitet. I sidstnævnte tilfælde driver de kontraktile-påførte spændinger ved cellens bageste strømmen af den cytosoliske væske mod cellefronten, hvilket supplerer den proteinpulje, der er nødvendig til lamellipodia-samling8. (ii) Det andet hovedtræk er, at afslapningen af spændinger er diffus og er karakteriseret ved en effektiv diffusionskonstant, , som afhænger af gelelastisk modul, gelporøsitet og opløsningsmiddelviskositet5. Den poroelastiske diffusionskonstant bestemmer, hvor hurtigt systemet reagerer på en påført spænding. Højere diffusionskonstanter svarer til hurtigere stressomfordeling. Dette bestemmer igen, hvor lang tid det tager for den intracellulære cytosoliske væske at blive omfordelt i cellen efter påført mekanisk belastning, det være sig ekstern eller intern, såsom de aktive kontraktile spændinger, der genereres af myosinmotorer. Disse eksempler viser således, at cytoskelettets og cytosolens mekanik er tæt koblet og ikke kan behandles separat3.
Da celler kan regulere deres mekaniske egenskaber på forskellige måder, er samspillet mellem netværksmekanik og væskestrømsdynamik stadig dårligt forstået. En stærk alternativ tilgang er at bruge in vitro rekonstituerede systemer, der giver mulighed for fuld kontrol over de forskellige mikroskopiske bestanddele og systemparametrene, hvilket gør disse modelsystemer optimale til fysisk analyse10,11. Denne tilgang er med succes blevet anvendt til at studere virkningen af proteinsammensætning og systemgeometri på aktinbaseret motilitet 12,13,14,15,16,17,18, 2D-mønsteret af actomyosinnetværk 19,20,21,22, og samspillet mellem netværkskontraktilitet og væskestrømningsdynamik af poroelastiske actomyosingeler, som er fokus for dette papir23.
I dette manuskript diskuteres fremstillingen af kontraktile elastiske actomyosinnetværk af kontrollerbare dimensioner og materialeegenskaber baseret på Ideses et al.23’s arbejde. Dynamikken i den kontraherende gel og det drænede opløsningsmiddel analyseres og kvantificeres, hvorigennem det demonstreres, at disse actomyosingeler kan beskrives som et poroelastisk aktivt materiale. Undersøgelse af virkningen af opløsningsmiddelviskositet på stressdiffusivitet bekræfter yderligere disse netværks poroelastiske karakter. De forskellige skaleringsrelationer, der bruges til datakvantificering, leveres. Endelig diskuteres også de eksperimentelle udfordringer, de almindelige faldgruber og relevansen af de eksperimentelle resultater for cellecytoskelettet.
Her anvendes en in vitro-tilgang til at karakterisere mekanikken i poroelastiske actomyosingeler som et modelsystem af cellecytoskelettet og mere generelt af cellecytoplasmaet, som har vist sig at opføre sig som et poroelastisk materiale 3,5. Reologien i cellecytoskelettet (cytoplasma) er blevet karakteriseret ved en poroelastisk diffusionskonstant, som dikterer, hvor lang tid det tager for den intracellulære cytosoliske væske at omfordele i cellen ef…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Dina Aranovich for proteinrensning og mærkning. G.L. er taknemmelig for Israels ministerium for videnskab, teknologi og rum for Jabotinsky ph.d.-stipendiet. A.B.G. er taknemmelig over for Israel Science Foundation (bevilling 2101/20) og til Ministeriet for Videnskab og Teknologi – Staten Israel (bevilling 3-17491) for økonomisk støtte.
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane | Sigma-Aldrich Company | 175617 | Stored under Argon atmosphere at 4 °C |
Acetic acid | Bio-Lab ltd | 1070521 | |
Alexa-Fluor 488 | Invitrogene | A10254 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
Alexa-Fluor 647 | Invitrogene | A20347 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
BSA | Sigma -Aldrich Company | A3059 | Stored at 4 °C |
Catalase | Sigma -Aldrich Company | C9322 | The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C |
Coverslips | Mezel-glaser | CG2222-1.5 | Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks |
Creatine kinase | Roche Life Science Products | 10736988001 | Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days. The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C |
Creatine phosphate | Roche Life Science Products | 10621714001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C |
DTT | Roche Life Science Products | 10708984001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months |
Dual view Simultaneous Imaging System | Photometrics | DV2-CUBE | |
EGTA | MP Biomedicals | 195174 | |
EM-CCD Camera | Andor Technology Ltd | DV 887 | |
EM-CCD Camera | Photometrics | Evolve Delta | |
Ethanol | Bio-Lab ltd | 525050300 | |
Flourescence Lamp | Rapp Optoelectronic | ||
Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences | 17151-10 | 200 nm diameter |
Glucose | ICN Biomedicals Inc | 194024 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. |
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich Company | G7141 | Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C |
Glycerol | ICN Biomedicals Inc | 800687 | |
Glycine | MP Biomedicals | 808822 | |
Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich Company | 216763 | Stored at 4 °C |
KCl | EMD Millipore Corp. | 529552 | |
Methanol | Bio-Lab ltd | 1368052100 | |
MgCl2 | EMD Millipore Corp. | 442615 | |
Microscope | Leica Microsystems | DMI3000 | |
mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-5k | Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C |
Nile red microspheres | Spherotech | FP-2056-2 | 2300 nm diameter |
Objective (10x) | Leica Germany | HC PL AP0 | UPlanFL Numerical Aperture = 0.3 |
Objective (2.5x) | Leica Germany | 506304 | Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075 |
Oven | WTC Binder | ||
Parafilm | Amcor | PM-996 | |
PBS Buffer | Sigma-Aldrich Company | P4417 | |
Shutter Driver | Vincet Associates | VMM D1 | |
Silica gel | Merck | 1.01907.5000 | |
Sonicator | Elma | Elmasonic P | |
Sulfuric acid | Carlo Erba reagents | 410301 | |
DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System | Photometrics | ||
TRIS | MP Biomedicals | 819620 | |
UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia | Ultraspec 2100 pro | |
MICROMAN E | Gilson | FD10001 | 1–10 uL |
MATLAB R2017b | MathWorks | Data quantification | |
MetaMorph | Molecular devices | Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size) |