सेल साइटोस्केलेटन की एक मॉडल प्रणाली के रूप में (पोरो-) इलास्टिक सिकुड़ा हुआ एक्टोमायोसिन नेटवर्क का यांत्रिकी
Summary
इस काम में, नियंत्रित परिस्थितियों में एक्टोमायोसिन जैल की पोरोइलास्टिसिटी का अध्ययन करने के लिए एक इन विट्रो पुनर्गठन दृष्टिकोण नियोजित किया जाता है। एक्टोमायोसिन जेल और एम्बेडेड विलायक की गतिशीलता निर्धारित की जाती है, जिसके माध्यम से नेटवर्क पोरोइलास्टिसिटी का प्रदर्शन किया जाता है। हम प्रयोगात्मक चुनौतियों, सामान्य नुकसान और सेल साइटोस्केलेटन यांत्रिकी की प्रासंगिकता पर भी चर्चा करते हैं।
Abstract
कोशिकाएं सक्रिय रूप से अपने आकार बदल सकती हैं और गतिशील बन सकती हैं, एक संपत्ति जो उनकी आंतरिक संरचना को सक्रिय रूप से पुनर्गठित करने की उनकी क्षमता पर निर्भर करती है। इस विशेषता को सेल साइटोस्केलेटन के यांत्रिक और गतिशील गुणों के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है, विशेष रूप से, एक्टोमायोसिन साइटोस्केलेटन, जो ध्रुवीय एक्टिन फिलामेंट्स, मायोसिन मोटर्स और सहायक प्रोटीन का एक सक्रिय जेल है जो आंतरिक संकुचन गुणों का प्रदर्शन करते हैं। आमतौर पर स्वीकृत दृष्टिकोण यह है कि साइटोस्केलेटन एक विस्कोस्टिक सामग्री के रूप में व्यवहार करता है। हालांकि, यह मॉडल हमेशा प्रयोगात्मक परिणामों की व्याख्या नहीं कर सकता है, जो साइटोस्केलेटन को एक पोरोइलास्टिक सक्रिय सामग्री के रूप में वर्णित करने वाली तस्वीर के साथ अधिक सुसंगत हैं- साइटोसोल के साथ एम्बेडेड एक लोचदार नेटवर्क। मायोसिन मोटर्स द्वारा उत्पन्न सिकुड़न ग्रेडिएंट जेल छिद्रों में साइटोसोल के प्रवाह को चलाते हैं, जो यह अनुमान लगाता है कि साइटोस्केलेटन और साइटोसोल के यांत्रिकी कसकर युग्मित हैं। पोरोइलास्टिसिटी की एक मुख्य विशेषता नेटवर्क में तनाव की सामान्य छूट है, जो एक प्रभावी प्रसार स्थिरांक की विशेषता है जो जेल लोचदार मापांक, छिद्र और साइटोसोल (विलायक) चिपचिपाहट पर निर्भर करता है। चूंकि कोशिकाओं के पास अपनी संरचना और भौतिक गुणों को विनियमित करने के कई तरीके हैं, इसलिए साइटोस्केलेटन यांत्रिकी और साइटोसोल प्रवाह गतिशीलता को कैसे युग्मित किया जाता है, इसकी हमारी वर्तमान समझ खराब समझ में आती है। यहां, सेल साइटोस्केलेटन के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में पोरोइलास्टिक एक्टोमायोसिन जैल के भौतिक गुणों को चिह्नित करने के लिए एक इन विट्रो पुनर्गठन दृष्टिकोण नियोजित किया जाता है। जेल संकुचन मायोसिन मोटर सिकुड़न द्वारा संचालित होता है, जो मर्मज्ञ विलायक के प्रवाह के उद्भव की ओर जाता है। पेपर बताता है कि इन जैल को कैसे तैयार किया जाए और प्रयोग ों को कैसे चलाया जाए। हम यह भी चर्चा करते हैं कि स्थानीय और वैश्विक दोनों पैमानों पर विलायक प्रवाह और जेल संकुचन को कैसे मापें और विश्लेषण करें। डेटा परिमाणीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न स्केलिंग संबंध दिए गए हैं। अंत में, प्रयोगात्मक चुनौतियों और आम नुकसान पर चर्चा की जाती है, जिसमें सेल साइटोस्केलेटन यांत्रिकी के लिए उनकी प्रासंगिकता शामिल है।
Introduction
जीवित कोशिकाओं में अद्वितीय यांत्रिक गुण होते हैं। लागू बलों पर निष्क्रिय रूप से प्रतिक्रिया करने की क्षमता के अलावा, वे बाहरी उत्तेजनाओं के जवाब में सक्रिय रूप से बल पैदा करने में भी सक्षमहैं। ये विशेषताएं, जो विभिन्न प्रकार की सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक हैं, विशेष रूप से सेल गतिशीलता के दौरान, मुख्य रूप से सेल साइटोस्केलेटन के यांत्रिक और गतिशील गुणों के लिए जिम्मेदार हैं, विशेष रूप से एक्टोमायोसिन साइटोस्केलेटन, जो ध्रुवीय एक्टिन फिलामेंट्स, मायोसिन आणविक मोटर्स और सहायक प्रोटीन का एक सक्रिय जेल है। ये एक्टोमायोसिन नेटवर्क मायोसिन मोटर प्रोटीन द्वारा संचालित आंतरिक आत्म-संगठन और संकुचन गुणों का प्रदर्शन करते हैं, जो एक्टिन फिलामेंट्स को क्रॉसलिंक करते हैं और एटीपी हाइड्रोलिसिस2 द्वारा संचालित नेटवर्क में सक्रिय रूप से यांत्रिक तनाव उत्पन्न करते हैं।
साइटोस्केलेटन3 के भौतिक गुणों का अध्ययन करने के लिए कई प्रयोगात्मक और सैद्धांतिक अध्ययन किए गए हैं। आमतौर पर स्वीकृत दृष्टिकोण यह है कि साइटोस्केलेटन एक विस्कोस्टिक सामग्रीके रूप में व्यवहार करता है। इसका मतलब यह है कि छोटे टाइमस्केल पर, साइटोस्केलेटन एक लोचदार सामग्री के रूप में व्यवहार करता है, और लंबे समय के पैमाने पर, यह क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन और मायोसिन मोटर डिटेचमेंट (और रीअटैचमेंट) के कारण चिपचिपा तरल पदार्थ के रूप में व्यवहार करता है, जो नेटवर्क को गतिशील रूप से कारोबार करने की अनुमति देता है। कई स्थितियों में, हालांकि, विस्कोस्टिक मॉडल प्रयोगात्मक परिणामों का वर्णन नहीं कर सकता है, जो साइटोस्केलेटन का वर्णन करने वाली तस्वीर के साथ अधिक सुसंगत हैं और, अधिक आम तौर पर, सेल साइटोप्लाज्म को पोरोइलास्टिक सक्रिय सामग्री 5,6 के रूप में वर्णित किया जा रहा है। दो मुख्य विशेषताएं इस प्रकार की सामग्रियों की विशेषता हैं। (i) पहली मुख्य विशेषता मायोसिन मोटर्स द्वारा संचालित सिकुड़न ग्रेडिएंट द्वारा जेल छिद्रों में मर्मज्ञ साइटोसोल (“विलायक”) के प्रवाह की पीढ़ी है, जो सेल ब्लीबिंग7, गतिशीलता8, और सेल आकार दोलन9 जैसी प्रक्रियाओं को रेखांकित करती है। इस तरह के साइटोसोलिक प्रवाह का उद्भव स्थानीय, ब्लीबिंग के लिए, या वैश्विक हो सकता है, जैसे सेल गतिशीलता में। बाद के मामले में, सेल रियर पर सिकुड़ा हुआ-लागू तनाव सेल के सामने की ओर साइटोसोलिक द्रव के प्रवाह को चलाता है, जो लैमेलिपोडिया असेंबली8 के लिए आवश्यक प्रोटीन पूल की भरपाई करता है। (ii) दूसरी मुख्य विशेषता यह है कि तनाव ों की छूट कम है और एक प्रभावी प्रसार स्थिरांक की विशेषता है, जो जेल लोचदार मापांक, जेल छिद्र और विलायक चिपचिपाहट5 पर निर्भर करता है। पोरोइलास्टिक प्रसार स्थिरांक यह निर्धारित करता है कि सिस्टम एक लागू तनाव के लिए कितनी तेजी से प्रतिक्रिया करता है। उच्च प्रसार स्थिरांक तेजी से तनाव पुनर्वितरण के अनुरूप हैं। यह, बदले में, यह निर्धारित करता है कि इंट्रासेल्युलर साइटोसोलिक द्रव को लागू यांत्रिक तनाव के बाद सेल के भीतर पुनर्वितरित करने में कितना समय लगता है, चाहे वह बाहरी या आंतरिक हो, जैसे कि मायोसिन मोटर्स द्वारा उत्पन्न सक्रिय सिकुड़ा हुआ तनाव। इस प्रकार, ये उदाहरण प्रदर्शित करते हैं कि साइटोस्केलेटन और साइटोसोल के यांत्रिकी कसकर युग्मित होते हैं और उन्हें अलग से इलाज नहीं किया जा सकताहै।
चूंकि कोशिकाएं अपने यांत्रिक गुणों को विभिन्न तरीकों से विनियमित कर सकती हैं, नेटवर्क यांत्रिकी और द्रव प्रवाह गतिशीलता के बीच परस्पर क्रिया को खराब तरीके से समझा जाता है। एक शक्तिशाली वैकल्पिक दृष्टिकोण इन विट्रो पुनर्गठित प्रणालियों का उपयोग करना है जो विभिन्न सूक्ष्म घटकों और सिस्टम मापदंडों के पूर्ण नियंत्रण की अनुमति देते हैं, जो इन मॉडल प्रणालियों को भौतिक विश्लेषण10,11 के लिए इष्टतम बनाता है। इस दृष्टिकोण को एक्टिन-आधारित गतिशीलता 12,13,14,15,16,17,18, एक्टोमायोसिन नेटवर्क 19,20,21,22 के 2 डी पैटर्न िंग पर प्रोटीन संरचना और सिस्टम ज्यामिति के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है।, और पोरोइलास्टिक एक्टोमायोसिन जैल के नेटवर्क सिकुड़न और द्रव प्रवाह गतिशीलता के बीच परस्पर क्रिया, जो इस पेपर23 का फोकस है।
इस पांडुलिपि में, नियंत्रणीय आयामों और भौतिक गुणों के सिकुड़ा हुआ लोचदार एक्टोमायोसिन नेटवर्क की तैयारी पर इडेस एट अल .23 के काम के आधार पर चर्चा की गई है। अनुबंध जेल और सूखा विलायक की गतिशीलता का विश्लेषण और मात्रा निर्धारित की जाती है, जिसके माध्यम से यह प्रदर्शित किया जाता है कि इन एक्टोमायोसिन जैल को पोरोइलास्टिक सक्रिय सामग्री के रूप में वर्णित किया जा सकता है। तनाव प्रसार पर विलायक चिपचिपाहट के प्रभाव का अध्ययन इन नेटवर्कों की पोरोइलास्टिक प्रकृति की पुष्टि करता है। डेटा परिमाणीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न स्केलिंग संबंध प्रदान किए जाते हैं। अंत में, प्रयोगात्मक चुनौतियों, आम नुकसान, और सेल साइटोस्केलेटन के लिए प्रयोगात्मक परिणामों की प्रासंगिकता पर भी चर्चा की जाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, एक इन विट्रो दृष्टिकोण को सेल साइटोस्केलेटन की एक मॉडल प्रणाली के रूप में पोरोइलास्टिक एक्टोमायोसिन जैल के यांत्रिकी को चिह्नित करने के लिए नियोजित किया जाता है और, अधिक आम तौर पर, सेल साइटोप?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्रोटीन शुद्धि और लेबलिंग के लिए दीना अरानोविच को धन्यवाद देना चाहते हैं। जीएल जबोटिंस्की पीएचडी छात्रवृत्ति के लिए इज़राइल के विज्ञान, प्रौद्योगिकी और अंतरिक्ष मंत्रालय के आभारी हैं। ए.बी.जी. वित्तीय सहायता के लिए इज़राइल साइंस फाउंडेशन (अनुदान 2101/20) और विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय – इज़राइल राज्य (अनुदान 3-17491) के लिए आभारी है।
Materials
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane | Sigma-Aldrich Company | 175617 | Stored under Argon atmosphere at 4 °C |
| Acetic acid | Bio-Lab ltd | 1070521 | |
| Alexa-Fluor 488 | Invitrogene | A10254 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| Alexa-Fluor 647 | Invitrogene | A20347 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| BSA | Sigma -Aldrich Company | A3059 | Stored at 4 °C |
| Catalase | Sigma -Aldrich Company | C9322 | The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C |
| Coverslips | Mezel-glaser | CG2222-1.5 | Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks |
| Creatine kinase | Roche Life Science Products | 10736988001 | Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days. The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C |
| Creatine phosphate | Roche Life Science Products | 10621714001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C |
| DTT | Roche Life Science Products | 10708984001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months |
| Dual view Simultaneous Imaging System | Photometrics | DV2-CUBE | |
| EGTA | MP Biomedicals | 195174 | |
| EM-CCD Camera | Andor Technology Ltd | DV 887 | |
| EM-CCD Camera | Photometrics | Evolve Delta | |
| Ethanol | Bio-Lab ltd | 525050300 | |
| Flourescence Lamp | Rapp Optoelectronic | ||
| Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences | 17151-10 | 200 nm diameter |
| Glucose | ICN Biomedicals Inc | 194024 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich Company | G7141 | Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C |
| Glycerol | ICN Biomedicals Inc | 800687 | |
| Glycine | MP Biomedicals | 808822 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich Company | 216763 | Stored at 4 °C |
| KCl | EMD Millipore Corp. | 529552 | |
| Methanol | Bio-Lab ltd | 1368052100 | |
| MgCl2 | EMD Millipore Corp. | 442615 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DMI3000 | |
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-5k | Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| Nile red microspheres | Spherotech | FP-2056-2 | 2300 nm diameter |
| Objective (10x) | Leica Germany | HC PL AP0 | UPlanFL Numerical Aperture = 0.3 |
| Objective (2.5x) | Leica Germany | 506304 | Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075 |
| Oven | WTC Binder | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| PBS Buffer | Sigma-Aldrich Company | P4417 | |
| Shutter Driver | Vincet Associates | VMM D1 | |
| Silica gel | Merck | 1.01907.5000 | |
| Sonicator | Elma | Elmasonic P | |
| Sulfuric acid | Carlo Erba reagents | 410301 | |
| DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System | Photometrics | ||
| TRIS | MP Biomedicals | 819620 | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia | Ultraspec 2100 pro | |
| MICROMAN E | Gilson | FD10001 | 1–10 uL |
| MATLAB R2017b | MathWorks | Data quantification | |
| MetaMorph | Molecular devices | Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size) |
References
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