세포 세포 골격의 모델 시스템으로서의 (Poro-) 탄성 수축 Actomyosin 네트워크의 역학
Summary
이 연구에서는 통제된 조건에서 악토미오신 겔의 다공성 탄성을 연구하기 위해 시험관 내 재구성 접근법을 사용합니다. 악토미오신 겔과 포매된 용매의 역학을 정량화하여 네트워크 다공탄성을 입증합니다. 또한 실험적 과제, 일반적인 함정 및 세포 골격 역학과의 관련성에 대해서도 논의합니다.
Abstract
세포는 적극적으로 모양을 바꾸고 운동성을 가질 수 있으며, 이는 내부 구조를 능동적으로 재구성하는 능력에 달려 있습니다. 이 특징은 세포 세포 골격의 기계적 및 동적 특성, 특히 고유 수축 특성을 나타내는 극성 액틴 필라멘트, 미오신 모터 및 보조 단백질의 활성 겔인 악토미오신 세포 골격에 기인합니다. 일반적으로 받아 들여지는 견해는 세포 골격이 점탄성 물질로 작용한다는 것입니다. 그러나 이 모델은 실험 결과를 항상 설명할 수 없으며, 이는 세포골격을 다공탄성 활성 물질(세포질에 내장된 탄성 네트워크)로 설명하는 그림과 더 일치합니다. 미오신 모터에 의해 생성된 수축성 구배는 겔 기공을 가로질러 세포질의 흐름을 유도하며, 이는 세포골격과 세포질의 역학이 밀접하게 결합되어 있음을 추론합니다. 다공탄성의 주요 특징 중 하나는 겔 탄성률, 다공성 및 세포질(용매) 점도에 따라 달라지는 효과적인 확산 상수를 특징으로 하는 네트워크의 응력 확산 완화입니다. 세포는 구조와 물질 특성을 조절할 수 있는 여러 가지 방법이 있기 때문에 세포 골격 역학과 세포질 흐름 역학이 어떻게 결합되는지에 대한 우리의 현재 이해는 잘 알려져 있지 않습니다. 여기서, 시험관 내 재구성 접근법은 세포 세포 골격에 대한 모델 시스템으로서 다공성 악토미오신 겔의 물질 특성을 특성화하기 위해 사용됩니다. 겔 수축은 미오신 운동 수축력에 의해 구동되며, 이는 침투 용매의 흐름의 출현으로 이어진다. 이 논문은 이러한 젤을 준비하고 실험을 실행하는 방법을 설명합니다. 또한 용매 흐름과 겔 수축을 지역 및 글로벌 규모에서 측정하고 분석하는 방법에 대해서도 논의합니다. 데이터 정량화에 사용되는 다양한 스케일링 관계가 제공됩니다. 마지막으로, 세포 세포 골격 역학과의 관련성을 포함하여 실험적 과제와 일반적인 함정에 대해 논의합니다.
Introduction
살아있는 세포는 독특한 기계적 성질을 가지고 있습니다. 적용된 힘에 수동적으로 반응하는 능력 외에도 외부 자극에 반응하여 능동적으로 힘을 생성할 수 있습니다1. 다양한 세포 과정, 특히 세포 운동성 동안 필수적인 이러한 특성은 주로 세포 세포 골격, 특히 극성 액틴 필라멘트, 미오신 분자 모터 및 부속 단백질의 활성 겔인 악토미오신 세포 골격의 기계적 및 동적 특성에 기인합니다. 이러한 악토미오신 네트워크는 액틴 필라멘트를 가교결합하고 ATP 가수분해에 의해 연료가 공급되는 네트워크에서 기계적 응력을 능동적으로 생성하는 미오신 운동 단백질에 의해 구동되는 고유한 자기 조직화 및 수축 특성을 나타냅니다2.
세포골격3의 물질적 성질을 연구하기 위해 수많은 실험적, 이론적 연구가 수행되었다. 일반적으로 받아 들여지는 견해는 세포 골격이 점탄성 물질로 행동한다는 것이다4. 즉, 짧은 시간 척도에서 세포 골격은 탄성 물질로 작용하고 긴 시간 척도에서는 가교 단백질과 미오신 운동 분리 (및 재 부착)로 인해 점성 유체로 작용하여 네트워크가 동적으로 회전할 수 있습니다. 그러나, 많은 상황에서, 점탄성 모델은 실험 결과를 설명할 수 없으며, 이는 세포골격 및 보다 일반적으로는 다공탄성 활성 물질로서 기술되는 세포 세포질을 기술하는 그림과 더 일치한다 5,6. 이러한 유형의 재료를 특징 짓는 두 가지 주요 특징이 있습니다. (i) 첫 번째 주요 특징은 세포 블리빙(cell blebbing)7, 운동성(motility)8, 세포 모양 진동(cell shape oscillation)9과 같은 과정의 기초가 되는 미오신 모터(myosin motor)에 의해 구동되는 수축성 구배(contractability gradients)에 의해 겔 공극을 가로지르는 관통 세포질(“용매”)의 흐름의 생성이다. 이러한 세포질 흐름의 출현은 세포 운동성과 같이 국소적, 출혈 또는 전 세계적일 수 있습니다. 후자의 경우, 세포 후면에 수축 가해진 응력은 세포질 유체의 흐름을 세포 전면으로 유도하여 라멜리포디아 조립에 필요한 단백질 풀을 보충한다8. (ii) 두 번째 주요 특징은 응력의 완화가 확산되고 겔 탄성률, 겔 다공성 및 용매 점도에 따라 달라지는 유효 확산 상수를 특징으로 한다는 것입니다5. 다공탄성 확산 상수는 시스템이 적용된 응력에 얼마나 빨리 반응하는지를 결정합니다. 확산 상수가 높을수록 응력 재분포가 빨라집니다. 이것은 차례로 미오신 모터에 의해 생성된 활성 수축 응력과 같은 외부 또는 내부의 기계적 응력을 가한 후 세포 내 세포질 유체가 세포 내에서 재분배되는 데 걸리는 시간을 결정합니다. 따라서 이러한 예는 세포 골격과 세포질의 역학이 밀접하게 결합되어 있으며 별도로 치료할 수 없음을 보여줍니다3.
세포는 다양한 방식으로 기계적 특성을 조절할 수 있기 때문에 네트워크 역학과 유체 흐름 역학 간의 상호 작용은 잘 이해되지 않고 있습니다. 강력한 대안적 접근법은 다양한 미세 성분 및 시스템 파라미터를 완전히 제어할 수 있는 시험관 내 재구성 시스템을 사용하는 것이며, 이는 이러한 모델 시스템을 물리적 분석에 최적으로 만듭니다(10,11). 이 접근법은 액틴 기반 운동성 12,13,14,15,16,17,18, 악토미오신 네트워크의 2D 패터닝에 대한 단백질 구성 및 시스템 기하학의 영향을 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다 19,20,21,22, 그리고 다공성 악토미오신 겔의 네트워크 수축성과 유체 흐름 역학 사이의 상호 작용, 이는 이 논문의 초점입니다23.
이 원고에서는 제어 가능한 치수 및 재료 특성의 수축성 탄성 악토미오신 네트워크의 준비는 Ideses et al.23의 연구를 기반으로 논의됩니다. 수축 겔과 배출 된 용매의 역학을 분석하고 정량화하여, 이러한 악토 미오신 겔이 다공성 활성 물질로 설명 될 수 있음을 입증합니다. 응력 확산도에 대한 용매 점도의 영향을 연구하면 이러한 네트워크의 다공성 탄성 특성을 추가로 확인할 수 있습니다. 데이터 정량화에 사용되는 다양한 스케일링 관계가 제공됩니다. 마지막으로, 실험 과제, 일반적인 함정 및 실험 결과와 세포 골격의 관련성에 대해서도 논의합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서, 시험관내 접근법은 세포 세포골격의 모델 시스템으로서, 그리고 보다 일반적으로는 다공탄성 물질로서 거동하는 것으로 밝혀진 세포 세포질의 다공탄성 악토미오신 겔의 역학을 특성화하기 위해 사용된다 3,5. 세포 세포 골격(세포질)의 유변학은 기계적 스트레스가 가해진 후 세포 내 세포질 유체가 세포 내에서 재분배되는 데 걸리는 시…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
단백질 정제 및 라벨링에 대해 Dina Aranovich에게 감사드립니다. GL은 Jabotinsky 박사 학위 장학금에 대해 이스라엘 과학 기술 우주부에 감사드립니다. ABG는 재정 지원에 대해 이스라엘 과학 재단(보조금 2101/20)과 이스라엘 과학 기술부(보조금 3-17491)에 감사드립니다.
Materials
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane | Sigma-Aldrich Company | 175617 | Stored under Argon atmosphere at 4 °C |
| Acetic acid | Bio-Lab ltd | 1070521 | |
| Alexa-Fluor 488 | Invitrogene | A10254 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| Alexa-Fluor 647 | Invitrogene | A20347 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| BSA | Sigma -Aldrich Company | A3059 | Stored at 4 °C |
| Catalase | Sigma -Aldrich Company | C9322 | The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C |
| Coverslips | Mezel-glaser | CG2222-1.5 | Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks |
| Creatine kinase | Roche Life Science Products | 10736988001 | Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days. The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C |
| Creatine phosphate | Roche Life Science Products | 10621714001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C |
| DTT | Roche Life Science Products | 10708984001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months |
| Dual view Simultaneous Imaging System | Photometrics | DV2-CUBE | |
| EGTA | MP Biomedicals | 195174 | |
| EM-CCD Camera | Andor Technology Ltd | DV 887 | |
| EM-CCD Camera | Photometrics | Evolve Delta | |
| Ethanol | Bio-Lab ltd | 525050300 | |
| Flourescence Lamp | Rapp Optoelectronic | ||
| Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences | 17151-10 | 200 nm diameter |
| Glucose | ICN Biomedicals Inc | 194024 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich Company | G7141 | Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C |
| Glycerol | ICN Biomedicals Inc | 800687 | |
| Glycine | MP Biomedicals | 808822 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich Company | 216763 | Stored at 4 °C |
| KCl | EMD Millipore Corp. | 529552 | |
| Methanol | Bio-Lab ltd | 1368052100 | |
| MgCl2 | EMD Millipore Corp. | 442615 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DMI3000 | |
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-5k | Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| Nile red microspheres | Spherotech | FP-2056-2 | 2300 nm diameter |
| Objective (10x) | Leica Germany | HC PL AP0 | UPlanFL Numerical Aperture = 0.3 |
| Objective (2.5x) | Leica Germany | 506304 | Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075 |
| Oven | WTC Binder | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| PBS Buffer | Sigma-Aldrich Company | P4417 | |
| Shutter Driver | Vincet Associates | VMM D1 | |
| Silica gel | Merck | 1.01907.5000 | |
| Sonicator | Elma | Elmasonic P | |
| Sulfuric acid | Carlo Erba reagents | 410301 | |
| DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System | Photometrics | ||
| TRIS | MP Biomedicals | 819620 | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia | Ultraspec 2100 pro | |
| MICROMAN E | Gilson | FD10001 | 1–10 uL |
| MATLAB R2017b | MathWorks | Data quantification | |
| MetaMorph | Molecular devices | Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size) |
References
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