Mekanikken til (poro-)elastiske kontraktile aktomyosinnettverk som et modellsystem av cellecytoskjelettet

Summary

I dette arbeidet brukes en in vitro rekonstitueringstilnærming for å studere poroelastisiteten til actomyoingeler under kontrollerte forhold. Dynamikken til actomyosingelen og det innebygde løsningsmidlet kvantifiseres, hvorved nettverksporoelastisiteten demonstreres. Vi diskuterer også eksperimentelle utfordringer, vanlige fallgruver og relevans for cellecytoskjelettmekanikk.

Abstract

Celler kan aktivt forandre sine former og bli bevegelige, en egenskap som avhenger av deres evne til aktivt å omorganisere sin indre struktur. Denne funksjonen tilskrives de mekaniske og dynamiske egenskapene til cellecytoskjelettet, spesielt actomyosincytoskelettet, som er en aktiv gel av polare aktinfilamenter, myosinmotorer og tilbehørsproteiner som utviser inneboende sammentrekningsegenskaper. Den vanligvis aksepterte oppfatningen er at cytoskjelettet oppfører seg som et viskoelastisk materiale. Denne modellen kan imidlertid ikke alltid forklare de eksperimentelle resultatene, som er mer konsistente med et bilde som beskriver cytoskjelettet som et poroelastisk aktivt materiale – et elastisk nettverk innebygd med cytosol. Kontraktilitetsgradienter generert av myosinmotorene driver strømmen av cytosol over gelporene, noe som antyder at mekanikken til cytoskjelettet og cytosolen er tett koblet. Et hovedtrekk ved poroelastisitet er diffusiv avslapning av spenninger i nettverket, karakterisert ved en effektiv diffusjonskonstant som avhenger av gelelastisk modul, porøsitet og cytosol (løsningsmiddel) viskositet. Siden celler har mange måter å regulere strukturen og materialegenskapene på, er vår nåværende forståelse av hvordan cytoskjelettmekanikk og cytosolstrømningsdynamikk er koblet sammen, fortsatt dårlig forstått. Her brukes en in vitro rekonstitueringstilnærming for å karakterisere materialegenskapene til poroelastiske actomyosingeler som et modellsystem for cellecytoskjelettet. Gelkontraksjon drives av myosinmotorisk kontraktilitet, noe som fører til fremveksten av en strøm av det penetrerende løsningsmidlet. Papiret beskriver hvordan du skal forberede disse gelene og kjøre eksperimenter. Vi diskuterer også hvordan man måler og analyserer løsemiddelstrømmen og gelkontraksjonen både på lokal og global skala. De ulike skaleringsrelasjonene som brukes til datakvantifisering er gitt. Til slutt diskuteres eksperimentelle utfordringer og vanlige fallgruver, inkludert deres relevans for cellecytoskjelettmekanikk.

Introduction

Levende celler har unike mekaniske egenskaper. Foruten evnen til passivt å reagere på påførte krefter, er de også i stand til aktivt å generere krefter som svar på ytre stimuli¹. Disse egenskapene, som er essensielle for en rekke cellulære prosesser, spesielt under cellemotilitet, tilskrives primært de mekaniske og dynamiske egenskapene til cellecytoskelettet, spesielt actomyosincytoskelettet, som er en aktiv gel av polare aktinfilamenter, myosinmolekylære motorer og tilbehørsproteiner. Disse actomyosinnettverkene utviser inneboende selvorganiserings- og sammentrekningsegenskaper drevet av myosinmotorproteinene, som kryssbinder aktinfilamentene og aktivt genererer mekaniske spenninger i nettverket drevet av ATP-hydrolyse².

Tallrike eksperimentelle og teoretiske studier har blitt utført for å studere materialegenskapene til cytoskelettet³. Den allment aksepterte oppfatningen er at cytoskjelettet oppfører seg som et viskoelastisk materiale⁴. Dette betyr at cytoskelettet på korte tidsskalaer oppfører seg som et elastisk materiale, og på lange tidsskalaer oppfører det seg som et viskøst væske på grunn av tverrbindende proteiner og myosinmotorisk løsrivelse (og reattachment), noe som gjør at nettverket dynamisk kan snu. Den viskoelastiske modellen kan imidlertid i mange situasjoner ikke beskrive de eksperimentelle resultatene, som er mer konsistente med et bilde som beskriver cytoskjelettet og mer generelt cellecytoplasma som beskrives som et poroelastisk virkestoff ^5,6. To hovedtrekk karakteriserer disse typer materialer. (i) Den første hovedfunksjonen er genereringen av en strøm av penetrerende cytosol (“løsningsmidlet”) over gelporene ved kontraktilitetsgradienter drevet av myosinmotorene, som ligger til grunn for prosesser som celleblebbing⁷, motilitet⁸ og celleformsvingninger⁹. Fremveksten av slike cytosoliske strømmer kan være lokal, for blebbing eller global, som i cellemotilitet. I sistnevnte tilfelle driver de kontraktile påførte spenningene ved cellens bakside strømmen av cytosolisk væske mot cellefronten, noe som etterfyller proteinbassenget som trengs for lamellipodimontering⁸. (ii) Den andre hovedfunksjonen er at avslapningen av spenninger er diffusiv og er preget av en effektiv diffusjonskonstant, , som avhenger av gelelastisiteten, gelporøsiteten og løsningsmiddelviskositeten⁵. Den poroelastiske diffusjonskonstanten bestemmer hvor raskt systemet reagerer på en påført spenning. Høyere diffusjonskonstanter tilsvarer raskere stressomfordeling. Dette bestemmer i sin tur hvor lang tid det tar for det intracellulære cytosoliske væsken å bli omfordelt i cellen etter påført mekanisk stress, det være seg eksternt eller internt, slik som de aktive kontraktile spenningene generert av myosinmotorer. Disse eksemplene viser dermed at mekanikken til cytoskjelettet og cytosolen er tett koblet og ikke kan behandles separat³.

Siden celler kan regulere sine mekaniske egenskaper på en rekke måter, er samspillet mellom nettverksmekanikk og væskestrømningsdynamikk fortsatt dårlig forstått. En kraftig alternativ tilnærming er å bruke in vitro rekonstituerte systemer som muliggjør full kontroll over de forskjellige mikroskopiske bestanddelene og systemparametrene, noe som gjør disse modellsystemene optimale for fysisk analyse^10,11. Denne tilnærmingen har blitt brukt til å studere virkningen av proteinsammensetning og systemgeometri på aktinbasert motilitet 12,13,14,15,16,17,18, 2D-mønstre av aktomyosinnettverk ^19,20,21,22, og samspillet mellom nettverkskontraktilitet og væskestrømningsdynamikk av poroelastiske actomyosingeler, som er fokus for denne artikkelen²³.

I dette manuskriptet diskuteres fremstilling av kontraktile elastiske aktomyosinnettverk med kontrollerbare dimensjoner og materialegenskaper basert på arbeidet til Ideses et ^al.23. Dynamikken til kontraheringsgelen og det drenerte løsningsmidlet analyseres og kvantifiseres, hvorved det er demonstrert at disse actomyosingelene kan beskrives som et poroelastisk aktivt materiale. Å studere effekten av løsningsmiddelviskositet på stressdiffusivitet bekrefter ytterligere den poroelastiske naturen til disse nettverkene. De ulike skaleringsrelasjonene som brukes til datakvantifisering er gitt. Til slutt diskuteres også de eksperimentelle utfordringene, de vanlige fallgruvene og relevansen av eksperimentelle resultater for cellecytoskjelettet.

Protocol

1. Glassoverflatebehandling og passivering: MERK: Denne delen inneholder tre hovedtrinn (se figur 1): (i) rengjøring og hydrofilisering, (ii) silanisering og (iii) overflatepassivering. Rengjøring og hydrofiliseringBruk Piranha-løsning for rengjøring av glassoverflate.MERK: Piranha-oppløsning er en blanding av 30%H2O2og 70%H2SO4(materialfortegnelse). Hovedmålet er å fjerne or…

Representative Results

To glassdeksel brukes per eksperiment. Glassdekslene rengjøres og passiveres med PEG-polymerer. Passivering er avgjørende for å forhindre at de solubiliserte proteinene fester seg til glassflatene i de tidlige eksperimentelle stadiene og for å minimere samspillet mellom det kontraherende nettverket og glassveggene. Unnlatelse av å oppnå god passivering kan føre til ineffektiv sammentrekning, og i ekstreme tilfeller kan det til og med hemme aktinnettverksdannelse. Fi…

Discussion

Her brukes en in vitro-tilnærming for å karakterisere mekanikken til poroelastiske actomyosingeler som et modellsystem av cellecytoskelettet og mer generelt av cellecytoplasma, som har vist seg å oppføre seg som et poroelastisk materiale ^3,5. Reologien til cellecytoskjelettet (cytoplasma) har vært preget av en poroelastisk diffusjonskonstant, som dikterer hvor lang tid det tar for det intracellulære cytosoliske væsken å omfordele seg i cellen ett…

Materials

(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane	Sigma-Aldrich Company	175617	Stored under Argon atmosphere at 4 °C
Acetic acid	Bio-Lab ltd	1070521
Alexa-Fluor 488	Invitrogene	A10254	Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C
Alexa-Fluor 647	Invitrogene	A20347	Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C
BSA	Sigma -Aldrich Company	A3059	Stored at 4 °C
Catalase	Sigma -Aldrich Company	C9322	The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C
Coverslips	Mezel-glaser	CG2222-1.5	Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks
Creatine kinase	Roche Life Science Products	10736988001	Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.  The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C
Creatine phosphate	Roche Life Science Products	10621714001	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C
DTT	Roche Life Science Products	10708984001	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months
Dual view Simultaneous Imaging System	Photometrics	DV2-CUBE
EGTA	MP Biomedicals	195174
EM-CCD Camera	Andor Technology Ltd	DV 887
EM-CCD Camera	Photometrics	Evolve Delta
Ethanol	Bio-Lab ltd	525050300
Flourescence Lamp	Rapp Optoelectronic
Fluoresbrite YG Microspheres	Polysciences	17151-10	200 nm diameter
Glucose	ICN Biomedicals Inc	194024	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months.
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich Company	G7141	Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C
Glycerol	ICN Biomedicals Inc	800687
Glycine	MP Biomedicals	808822
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich Company	216763	Stored at 4 °C
KCl	EMD Millipore Corp.	529552
Methanol	Bio-Lab ltd	1368052100
MgCl2	EMD Millipore Corp.	442615
Microscope	Leica Microsystems	DMI3000
mPEG-mal	Nanocs	PG1-ML-5k	Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C
Nile red microspheres	Spherotech	FP-2056-2	2300 nm diameter
Objective (10x)	Leica Germany	HC PL AP0	UPlanFL Numerical Aperture = 0.3
Objective (2.5x)	Leica Germany	506304	Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075
Oven	WTC Binder
Parafilm	Amcor	PM-996
PBS Buffer	Sigma-Aldrich Company	P4417
Shutter Driver	Vincet Associates	VMM D1
Silica gel	Merck	1.01907.5000
Sonicator	Elma	Elmasonic P
Sulfuric acid	Carlo Erba reagents	410301
DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System	Photometrics
TRIS	MP Biomedicals	819620
UV-VIS Spectrophotometer	Pharmacia	Ultraspec 2100 pro
MICROMAN E	Gilson	FD10001	1–10 uL
MATLAB R2017b	MathWorks		Data quantification
MetaMorph	Molecular devices		Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)