La mecánica de las redes de actomiosina contráctil (poro-)elástica como sistema modelo del citoesqueleto celular
Summary
En este trabajo, se emplea un enfoque de reconstitución in vitro para estudiar la poroelasticidad de los geles de actomiosina en condiciones controladas. Se cuantifica la dinámica del gel de actomiosina y el disolvente incrustado, a través de la cual se demuestra la porosidad de la red. También discutimos los desafíos experimentales, las trampas comunes y la relevancia para la mecánica del citoesqueleto celular.
Abstract
Las células pueden cambiar activamente sus formas y volverse móviles, una propiedad que depende de su capacidad para reorganizar activamente su estructura interna. Esta característica se atribuye a las propiedades mecánicas y dinámicas del citoesqueleto celular, en particular, el citoesqueleto de actomiosina, que es un gel activo de filamentos de actina polar, motores de miosina y proteínas accesorias que exhiben propiedades de contracción intrínsecas. La opinión generalmente aceptada es que el citoesqueleto se comporta como un material viscoelástico. Sin embargo, este modelo no siempre puede explicar los resultados experimentales, que son más consistentes con una imagen que describe el citoesqueleto como un material activo poroelástico, una red elástica incrustada con citosol. Los gradientes de contractilidad generados por los motores de miosina impulsan el flujo del citosol a través de los poros del gel, lo que infiere que la mecánica del citoesqueleto y el citosol están estrechamente acoplados. Una característica principal de la poroelasticidad es la relajación difusiva de las tensiones en la red, caracterizada por una constante de difusión efectiva que depende del módulo elástico del gel, la porosidad y la viscosidad del citosol (solvente). Como las células tienen muchas formas de regular su estructura y propiedades materiales, nuestra comprensión actual de cómo se acoplan la mecánica del citoesqueleto y la dinámica del flujo del citosol sigue siendo poco conocida. Aquí, se emplea un enfoque de reconstitución in vitro para caracterizar las propiedades materiales de los geles de actomiosina poroelásticos como un sistema modelo para el citoesqueleto celular. La contracción del gel es impulsada por la contractilidad motora de la miosina, lo que conduce a la aparición de un flujo del disolvente penetrante. El documento describe cómo preparar estos geles y realizar experimentos. También discutimos cómo medir y analizar el flujo de solvente y la contracción del gel tanto a escala local como global. Se dan las diversas relaciones de escala utilizadas para la cuantificación de datos. Finalmente, se discuten los desafíos experimentales y las trampas comunes, incluida su relevancia para la mecánica del citoesqueleto celular.
Introduction
Las células vivas tienen propiedades mecánicas únicas. Además de la capacidad de reaccionar pasivamente a las fuerzas aplicadas, también son capaces de generar activamente fuerzas en respuesta a estímulos externos1. Estas características, que son esenciales para una variedad de procesos celulares, especialmente durante la motilidad celular, se atribuyen principalmente a las propiedades mecánicas y dinámicas del citoesqueleto celular, especialmente el citoesqueleto de actomiosina, que es un gel activo de filamentos de actina polar, motores moleculares de miosina y proteínas accesorias. Estas redes de actomiosina exhiben propiedades intrínsecas de autoorganización y contracción impulsadas por las proteínas motoras de miosina, que entrecruzan los filamentos de actina y generan activamente tensiones mecánicas en la red alimentadas por la hidrólisisde ATP 2.
Se han realizado numerosos estudios experimentales y teóricos para estudiar las propiedades materiales del citoesqueleto3. La opinión comúnmente aceptada es que el citoesqueleto se comporta como un material viscoelástico4. Esto significa que en escalas de tiempo cortas, el citoesqueleto se comporta como un material elástico, y en escalas de tiempo largas, se comporta como un fluido viscoso debido a las proteínas de reticulación y al desprendimiento motor de miosina (y reconexión), lo que permite que la red se mueva dinámicamente. En muchas situaciones, sin embargo, el modelo viscoelástico no puede describir los resultados experimentales, que son más consistentes con una imagen que describe el citoesqueleto y, más generalmente, el citoplasma celular que se describe como un material activo poroelástico 5,6. Dos características principales caracterizan este tipo de materiales. (i) La primera característica principal es la generación de un flujo del citosol penetrante (el “solvente”) a través de los poros del gel por gradientes de contractilidad impulsados por los motores de miosina, que subyace a procesos como el blebbing celular7, la motilidad8 y las oscilaciones de la forma celular9. La aparición de tales flujos citosólicos puede ser local, para ampollar, o global, como en la motilidad celular. En este último caso, las tensiones contráctiles aplicadas en la parte posterior de la célula impulsan el flujo del líquido citosólico hacia el frente celular, lo que repone el conjunto de proteínas necesarias para el ensamblaje de lamellipodia8. (ii) La segunda característica principal es que la relajación de las tensiones es difusiva y se caracteriza por una constante de difusión efectiva, , que depende del módulo elástico del gel, la porosidad del gel y la viscosidad del disolvente5. La constante de difusión poroelástica determina qué tan rápido responde el sistema a una tensión aplicada. Las constantes de difusión más altas corresponden a una redistribución de tensiones más rápida. Esto, a su vez, determina cuánto tiempo tarda el líquido citosólico intracelular en redistribuirse dentro de la célula después de la tensión mecánica aplicada, ya sea externa o interna, como las tensiones contráctiles activas generadas por los motores de miosina. Estos ejemplos, por lo tanto, demuestran que la mecánica del citoesqueleto y el citosol están estrechamente acoplados y no pueden ser tratados por separado3.
Como las células pueden regular sus propiedades mecánicas de varias maneras, la interacción entre la mecánica de red y la dinámica del flujo de fluidos sigue siendo poco conocida. Un enfoque alternativo poderoso es el uso de sistemas reconstituidos in vitro que permiten un control total de los diversos componentes microscópicos y los parámetros del sistema, lo que hace que estos sistemas modelo sean óptimos para el análisis físico10,11. Este enfoque se ha empleado con éxito para estudiar el impacto de la composición de proteínas y la geometría del sistema en la motilidad basada en actina 12,13,14,15,16,17,18, el patrón 2D de las redes de actomiosina 19,20,21,22, y la interacción entre la contractilidad de la red y la dinámica del flujo de fluidos de geles de actomiosina poroelástica, que es el foco de este trabajo23.
En este manuscrito se discute la preparación de redes de actomiosina elásticas contráctiles de dimensiones controlables y propiedades del material basadas en el trabajo de Ideses et al.23. Se analiza y cuantifica la dinámica del gel de contracción y el disolvente drenado, a través de los cuales se demuestra que estos geles de actomiosina pueden describirse como un material activo poroelástico. El estudio del efecto de la viscosidad del disolvente sobre la difusividad de tensión confirma aún más la naturaleza poroelástica de estas redes. Se proporcionan las diversas relaciones de escala utilizadas para la cuantificación de datos. Finalmente, también se discuten los desafíos experimentales, las trampas comunes y la relevancia de los resultados experimentales para el citoesqueleto celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, se emplea un enfoque in vitro para caracterizar la mecánica de los geles poroelásticos de actomiosina como un sistema modelo del citoesqueleto celular y, más generalmente, del citoplasma celular, que ha demostrado comportarse como un material poroelástico 3,5. La reología del citoesqueleto celular (citoplasma) se ha caracterizado por una constante de difusión poroelástica, que dicta cuánto tiempo tarda el líquido citosólico intracelular …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Dina Aranovich por la purificación y el etiquetado de proteínas. G.L. agradece al Ministerio de Ciencia, Tecnología y Espacio de Israel por la beca de doctorado Jabotinsky. A.B.G. agradece a la Fundación de Ciencia de Israel (subvención 2101/20) y al Ministerio de Ciencia y Tecnología – Estado de Israel (subvención 3-17491) por su apoyo financiero.
Materials
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane | Sigma-Aldrich Company | 175617 | Stored under Argon atmosphere at 4 °C |
| Acetic acid | Bio-Lab ltd | 1070521 | |
| Alexa-Fluor 488 | Invitrogene | A10254 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| Alexa-Fluor 647 | Invitrogene | A20347 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| BSA | Sigma -Aldrich Company | A3059 | Stored at 4 °C |
| Catalase | Sigma -Aldrich Company | C9322 | The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C |
| Coverslips | Mezel-glaser | CG2222-1.5 | Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks |
| Creatine kinase | Roche Life Science Products | 10736988001 | Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days. The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C |
| Creatine phosphate | Roche Life Science Products | 10621714001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C |
| DTT | Roche Life Science Products | 10708984001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months |
| Dual view Simultaneous Imaging System | Photometrics | DV2-CUBE | |
| EGTA | MP Biomedicals | 195174 | |
| EM-CCD Camera | Andor Technology Ltd | DV 887 | |
| EM-CCD Camera | Photometrics | Evolve Delta | |
| Ethanol | Bio-Lab ltd | 525050300 | |
| Flourescence Lamp | Rapp Optoelectronic | ||
| Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences | 17151-10 | 200 nm diameter |
| Glucose | ICN Biomedicals Inc | 194024 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich Company | G7141 | Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C |
| Glycerol | ICN Biomedicals Inc | 800687 | |
| Glycine | MP Biomedicals | 808822 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich Company | 216763 | Stored at 4 °C |
| KCl | EMD Millipore Corp. | 529552 | |
| Methanol | Bio-Lab ltd | 1368052100 | |
| MgCl2 | EMD Millipore Corp. | 442615 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DMI3000 | |
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-5k | Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| Nile red microspheres | Spherotech | FP-2056-2 | 2300 nm diameter |
| Objective (10x) | Leica Germany | HC PL AP0 | UPlanFL Numerical Aperture = 0.3 |
| Objective (2.5x) | Leica Germany | 506304 | Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075 |
| Oven | WTC Binder | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| PBS Buffer | Sigma-Aldrich Company | P4417 | |
| Shutter Driver | Vincet Associates | VMM D1 | |
| Silica gel | Merck | 1.01907.5000 | |
| Sonicator | Elma | Elmasonic P | |
| Sulfuric acid | Carlo Erba reagents | 410301 | |
| DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System | Photometrics | ||
| TRIS | MP Biomedicals | 819620 | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia | Ultraspec 2100 pro | |
| MICROMAN E | Gilson | FD10001 | 1–10 uL |
| MATLAB R2017b | MathWorks | Data quantification | |
| MetaMorph | Molecular devices | Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size) |
References
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