En musmodell av orotrakeal intubation och ventilerad lungischemi reperfusionskirurgi

Summary

En muskirurgisk modell för att skapa skada på vänster lungischemireperfusion (IR) samtidigt som ventilationen bibehålls och hypoxi undviks.

Abstract

Ischemireperfusionsskada (IR) beror ofta på processer som involverar en övergående period av avbrutet blodflöde. I lungan tillåter isolerad IR experimentell studie av denna specifika process med fortsatt alveolär ventilation, vilket undviker de sammansatta skadliga processerna av hypoxi och atelektas. I det kliniska sammanhanget orsakas lungischemireperfusionsskada (även känd som lung-IRI eller LIRI) av många processer, inklusive men inte begränsat till lungemboli, återupplivat hemorragiskt trauma och lungtransplantation. Det finns för närvarande begränsade effektiva behandlingsalternativ för LIRI. Här presenterar vi en reversibel kirurgisk modell av lung-IR som involverar första orotrakeal intubation följt av ensidig vänster lungischemi och reperfusion med bevarad alveolär ventilation eller gasutbyte. Möss genomgår en vänster torakotomi, genom vilken den vänstra lungartären exponeras, visualiseras, isoleras och komprimeras med hjälp av en reversibel slipknot. Det kirurgiska snittet stängs sedan under den ischemiska perioden, och djuret väcks och extuberas. När musen spontant andas etableras reperfusion genom att släppa slipknoten runt lungartären. Denna kliniskt relevanta överlevnadsmodell möjliggör utvärdering av lung-IR-skada, upplösningsfasen, nedströms effekter på lungfunktionen samt två-hit-modeller som involverar experimentell lunginflammation. Även om det är tekniskt utmanande kan denna modell behärskas under några veckor till månader med en eventuell överlevnads- eller framgångsgrad på 80% -90%.

Introduction

Ischemireperfusionsskada (IR) kan uppstå när blodflödet återställs till en organ- eller vävnadsbädd efter en viss tids avbrott. I lungan kan IR förekomma isolerat eller i samband med andra skadliga processer såsom infektion, hypoxi, atelektas, volutrauma (från höga tidvattenvolymer under mekanisk ventilation), barotrauma (hög topp eller ihållande tryck under mekanisk ventilation) eller trubbig (icke-penetrerande) lungkontusionsskada ^1,2,3 . Det finns fortfarande flera luckor i vår kunskap om mekanismerna för LIRI och effekterna av samtidiga processer (t.ex. infektion) på LIRI-resultat, och även behandlingsalternativen för LIRI är begränsade. En in vivo-modell av ren LIRI krävs för att identifiera patofysiologin för lung-IR-skada isolerat och för att studera dess bidrag till alla multi-hit-processer där lungskada är en komponent.

Murin lung-IR-modeller kan användas för att studera den lungspecifika patofysiologin för flera processer, inklusive lungtransplantation³, lungemboli⁴ och lungskada efter hemorragiskt trauma med återupplivning⁵. För närvarande används modeller inkluderar kirurgisk lungtransplantation⁶, hilar clamping⁷, ex vivo lungperfusion⁸ och ventilerad lunga IR⁹. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för en murin ventilerad lung-IR-modell av steril lungskada. Det finns flera fördelar med detta tillvägagångssätt (figur 2), inklusive att det inducerar minimal hypoxi och minimal atelektas, och det är en överlevnadskirurgimodell som möjliggör långtidsstudier.

Skäl att välja denna modell av LIRI framför andra modeller som hilar clamping och ex vivo perfusionsmodeller är följande: denna modell minimerar de inflammatoriska bidragen från atelektas, mekanisk ventilation och hypoxi; det bevarar cyklisk ventilation; det upprätthåller ett intakt in vivo cirkulationsimmunsystem som kan svara på IR-skadan; och slutligen, som ett överlevnadsförfarande, tillåter det en mer långsiktig analys av mekanismerna för sekundär skadegenerering (2-träffmodeller) och skadeupplösning. Sammantaget tror vi att denna ventilerade lung-IR-modell ger den “renaste” formen av IR-skada som kan studeras experimentellt.

Andra publikationer har beskrivit användningen av orotrakeal intubation av möss för att utföra IT-injektioner eller installationer^10,11, men inte som utgångspunkt för en överlevnadsoperation som det är i denna modell. Placeringen av ett orotrakealt rör möjliggör utförandet av lungkirurgi genom att tillåta kollaps av den operativa lungan. Det möjliggör också återinflation av lungan i slutet av proceduren, vilket är avgörande för pneumotoraxen och för musens förmåga att återgå till spontan ventilation vid slutet av procedurerna. Slutligen är avlägsnandet av det säkrade orotrakealröret ett enkelt förfarande som, till skillnad från en invasiv trakeotomi, är kompatibelt med en överlevnadsoperation. Detta möjliggör långsiktiga forskningsstudier med fokus på att förstå progressionen och upplösningen av LIRI och associerade störningar, samt skapandet av kroniska skademodeller.

Protocol

Alla procedurer och steg som beskrivs nedan godkändes av den institutionella djurvårds- och användningskommittén (IACUC) vid University of California San Francisco. Vilken musstam som helst kan användas, även om vissa stammar har ett mer robust inflammatoriskt svar i lungan jämfört med andra12. Möss som är ungefär 12-15 veckors ålder (30-40 g) eller äldre tolererar och överlever lung-IR-operationen bättre än yngre möss. Både manliga och kvinnliga möss kan användas för dessa op…

Representative Results

Inflammation genererad av ensidig ventilerad steril lungischemireperfusion (IR) -skada: Efter 1 h ischemi observerade vi ökade nivåer av cytokiner i serumet och i lungvävnaden av både ELISA och qRT-PCR som nådde en topp på 1 h efter reperfusion och snabbt återvände till baslinjen inom 12-24 timmar efter reperfusion13. För prover som samlades in vid 3 timmar efter reperfusion observerade vi intensiv neutrofil infiltration i den vänstra lungvävnaden och noterade att inflammationens intens…

Discussion

Detta manuskript beskriver stegen för att utföra den ventilerade lung-IR-modellen som utvecklats av Dodd-o et ^al.9. Denna modell har hjälpt till att identifiera molekylära vägar som är involverade i generering och upplösning av inflammation från lung-IR isolerat 14,15,16,17, lung-IR i kombination med samtidig infektion 18 och lung-IR i förhållande till tarm-lungaxeln och bidraget från tarmmikrobiomet^{13,18,19</s…}

Materials

Equipment
Fiber Optic Light Pipe	Cole-Parmer	UX-41720-65	Fiberoptic light pipe
Fiber Optic Light Source	AmScope	SKU: CL-HL250-B	Light source for fiberoptic lights
Germinator 500	Cell Point Scientific, Inc.	No.5-1450	Bead Sterilizer
Heating Pad	AIMS	14-370-223	Alternative option
Lithium.Ion Grooming Kits(hair clipper)	WAHL home products	SKU 09854-600B	To remove mouse hair on surgical site
Microscope	Nikon	SMZ-10	Other newer options available at the company website
MiniVent Ventilator	Havard Apparatus	Model 845	Mouse ventilator
Ultrasonic Cleaner	Cole-Parmer	UX-08895-05	Clean tools that been used in operation
Warming Pad	Kent Scientific	RT-0501	To keep mouse warm while recovering from surgery
Weighing Scale	Cole-Parmer	UX-11003-41	Weighing scale
Surgery Tools
4-0 Silk Suture	Ethicon	683G	For closing muscle layer
7-0 Prolene Suture	Ethicon Industry	EP8734H	Using for making a slip knot of left pulmonary artery
Bard-Parker (11) Scalpel (Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade, sterile, single use)	Aspen Surgical	372611	For entering thoracic cavity (option 1)
Bard-Parker (12) Scalpel	Aspen Surgical	372612	For entering thoracic cavity (option 2)
Extra Fine Graefe Forceps	FST	11150-10	Muscle/rib holding forceps
Magnetic Fixator Retraction System	FST	1. Base Plate (Nos. 18200-03) 2. Fixators (Nos. 18200-01) 3. Retractors (Nos. 18200-05 through 18200-12) 4. Elastomer (Nos.18200-07) 5. Retractor(No.18200-08)	Small Animal Retraction System
Monoject Standard Hypodermic Needle	COVIDIEN	05-561-20	For medication delivery IP
Narrow Pattern Forceps	FST	11002-12	Skin level forceps
Needle holder/Needle driver	FST	12565-14	for holding needles
Needles	BD	305110	26 gauge needle for externalizing slipknot (24 or 26 gauge needle okay too)
PA/Vessel Dilating forceps	FST	00125-11	To hold PA; non-damaging gripper
Scissors	FST	14060-09	Used for incision and cutting into the muscular layer durging surgery
Ultra Fine Dumont micro forceps	FST	11295-10 (Dumont #5 forceps, Biology tip, tip dimension:0.05*0.02mm,11cm)	For passing through the space between the left pulmonary artery and bronchus
Reagents
0.25% Bupivacaine	Hospira, Inc.	0409-1159-02	Topical analgesic used during surgical wound closure
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)	Sigma-Aldrich	T48402-25G	Anesthetic, using for anesthetize the mouse for IR surgery, the concentration used in IR surgery is 250-400 mg/kg.
Buprenorphine	Covetrus North America	59122	Analgesic: concentration used for surgery is 0.05-0.1 mg/kg
Eye Lubricant	BAUSCH+LOMB	Soothe Lubricant Eye Ointment	Relieves dryness of the eye
Povidone-Iodine 10% Solution	MEDLINE INDUSTRIES INC	SKU MDS093944H (2 FL OZ, topical antiseptic)	Topical liquid applied for an effective first aid antiseptic at beginning of surgery
Materials
Alcohol Swab	BD brand	BD 326895	for sterilzing area of injection and surgery
Plastic film	KIRKLAND	Stretch-Tite premium	Alternative for covering the sterilized surgical field (more cost effective)
Rodent Surgical Drapes	Stoelting	50981	Sterile field or drape for surgical field
Sterile Cotton Tipped Application	Pwi-Wnaps	703033	used for applying eye lubricant
Top Sponges	Dukal Corporaton	Reorder # 5360	Stopping bleeding from skin/muscle