Här presenterar vi ett protokoll för att utveckla genmodifierade musmodeller med embryonala stamceller, speciellt för stora DNA-knock-in (KI). Detta protokoll är inställt med hjälp av CRISPR/Cas9-genomredigering, vilket resulterar i signifikant förbättrad KI-effektivitet jämfört med den konventionella homologa rekombinationsmedierade linjäriserade DNA-inriktningsmetoden.
CRISPR/Cas9-systemet har gjort det möjligt att utveckla genetiskt modifierade möss genom direkt genomredigering med hjälp av befruktade zygoter. Men även om effektiviteten i att utveckla gen-knockout-möss genom att inducera liten indelmutation skulle vara tillräcklig, är effektiviteten av embryogenomredigering för att göra stor DNA-knock-in (KI) fortfarande låg. Därför, till skillnad från den direkta KI-metoden i embryon, har geninriktning med embryonala stamceller (ESC) följt av embryoinjektion för att utveckla chimärmöss fortfarande flera fördelar (t.ex. hög genomströmning riktad in vitro, multi-allelmanipulation och Cre – och flox-genmanipulation kan utföras på kort tid). Dessutom kan stammar med svårhanterliga embryon in vitro, såsom BALB/c, också användas för ESC-inriktning. Detta protokoll beskriver den optimerade metoden för storskaligt DNA (flera kb) KI i ESC genom att tillämpa CRISPR/Cas9-medierad genomredigering följt av chimärmössproduktion för att utveckla genmanipulerade musmodeller.
Genom att producera genetiskt modifierade möss och analysera deras fenotyp kan vi förstå specifika genfunktioner i detalj, in vivo. Många viktiga fynd har upptäckts med hjälp av genmodifierade djurmodeller inom life science-området. Sedan rapporten om genomredigeringsteknik med CRISPR/Cas91 har forskning med genetiskt modifierade möss dessutom snabbt spridit sig till många laboratorier 2,3. Genomredigering av muszygoter med CRISPR/Cas9 har uppnått acceptabel effektivitet för att utveckla kort DNA-modifiering, såsom indelmutationsorienterad gen knockout4, enkel nukleotidersättning eller kort peptidtagginsättning med enkelsträngade oligonukleotider (ssODN) som knock-in (KI) givare5. Å andra sidan förblir KI för stora DNA-fragment i zygoter genom genomredigering låg effektivitet jämfört med den kortstora DNA-modifieringen 6,7. Dessutom är det svårt att använda musstammar som BALB/c, som är en viktig stam för specifika forskningsområden som immunologi, för zygotbaserad genomredigering eftersom deras preimplantatoriska embryon är mottagliga för in vitro-manipulation.
Ett annat sätt att utveckla genetiskt modifierade musmodeller är att använda den embryonala stamcellsinriktningstekniken (ESC) följt av ESC-injektion i preimplantatoriskt embryo för att producera chimärer 8,9,10, som fortfarande rutinmässigt används som en konventionell metod. Även om förvärvsgraden för att erhålla exakta KI-ESC-kloner inte är särskilt hög i konventionella ESC-inriktningsmetoder, erbjuder ESC-inriktning vissa fördelar jämfört med zygotgenomredigering, särskilt för lång DNA KI. Till exempel är KI-effektiviteten hos långa DNA-fragment (> flera kb) i zygotgenomet mindre tydlig6,7, och många zygoter behövs för att utveckla ens en linje av KI-mus, vilket är oönskat i det nuvarande perspektivet av djurförsök. Till skillnad från zygotgenomredigering behöver lång DNA-inriktning på ESC följt av chimärproduktion betydligt färre embryon än zygotgenomredigering. Även om de preimplantatoriska embryona från BALB/c är mottagliga för in vitro-manipulation, kan deras ESC bibehållas och hanteras in vitro 11 som andra kompetenta 129- eller F1-bakgrunds-ESC, därför tillämpliga för chimärproduktioner. Men även om en målvektor innehåller 5′ och 3′ homologa armar och läkemedelsresistensgenkassetter för positivt eller negativt urval, är den konventionella KI-effektiviteten hos ESC i allmänhet otillräcklig på grund av den höga frekvensen av slumpmässig genomisk integration 8,10, Således krävs en förbättrad metod med exakt ESC-inriktningseffektivitet. Nyligen rapporterade vi en trimmad ESC KI-metod med CRISPR/Cas9-baserad genomredigering för att uppnå högre KI-effektivitet än konventionella inriktningsmetoder11. Metoden vi beskriver här är baserad på denna procedur som möjliggör långt DNA (> flera till 10 kb) KI till ESC med acceptabel effektivitet för rutinmässiga arbeten utan läkemedelsval; Således skulle vektorkonstruktionsförfarandet vara mycket enklare och behöva en kortare period, annars skulle cellodlingsperioden också bli betydligt kortare.
Geninriktning av ESC följt av chimärproduktion har konventionellt använts för att utveckla genmanipulerade möss. Ändå förblir gen-knock-in-effektiviteten låg trots att målvektorn innehåller långa (> flera kb i vanliga) homologiarmar med positiva eller negativa läkemedelsselektionsgenkassetter. Vårt protokoll introducerade en avstämd ESC KI-metod för långt exogent DNA med användning av en cirkulär plasmid utan några läkemedelsvalkassetter som en målvektor åtföljd av Cas9-RNP-medierad genomredigering med en acceptabel effektivitet för rutinarbeten. Således kan detta protokoll bidra till att avsevärt minska den tid det tar att producera genetiskt modifierade chimära möss jämfört med den konventionella ESC-inriktningen.
I detta protokoll använde vi CRISPR/Cas9-RNP för att inducera platsspecifika dubbelsträngsbrott i genomet, och en cirkulär plasmid användes som målvektor istället för en linjäriserad. Linjäriserade plasmider används konventionellt som en målvektor för gen KI på grund av deras ökade effektivitet av genomisk integration 8,9,10. Många genomiska integrationer är dock ospecifika trots att vektorn innehåller homologa armar9. Å andra sidan används cirkulära plasmider sällan som inriktningsvektorer på grund av deras svårintegrerade funktion i genomet hos ESC12 eller fibroblaster13. Således skulle det vara möjligt att applicering av en cirkulär plasmid som en inriktningsvektor åtföljd av CRISPR / Cas9-medierad genomredigering minimerar ospecifik slumpmässig integration men maximerar den platsspecifika integrationen i ESC-genomet. Det skulle vara anmärkningsvärt att induktionseffektiviteten hos dubbelsträngsbrottet med CRISPR / Cas9 är ganska viktigt14, så det skulle vara viktigt att använda gRNA som inducerar en dubbelsträngsbrytning med hög effektivitet. Det bör övervägas att omforma gRNA när KI-effektiviteten är för låg. I det fall som visas i figur 2 visade 40,9 % av ESC-klonerna ett KI-specifikt band. Faktum är att vi som institutets kärnlaboratorium rutinmässigt utför geninriktning med hjälp av ESC med den metod som beskrivs här och har uppnått KI-effektivitet på 10% -50% för 1-2 kb-sekvenser som Cre, CreERT eller fluorescerande reportrar, även om det finns vissa variationer beroende på genlokus. De längsta DNA-sekvenser vi framgångsrikt har KI med denna metod är cirka 11,2 kb in i Rosa26-locus, och effektiviteten var 12,2% (fem KI-kolonier av 41 analyserade kolonier).
Det bör också noteras att detta protokoll använder embryon i åttacells- eller morulastadiet som mottagare för ESC-mikroinjektion men inte blastocyststadiumembryon. Även om vi inte har genomfört jämförande experiment i detta dokument, har flera rapporter visat att injektion av ESC i åttacells- eller morula-embryon avsevärt förbättrar effektiviteten av ESC-bidrag till chimära avkommor jämfört med ESC-injektionen i blastocyster15,16,17,18 . Faktum är att ESC-injektioner av olika ESC-linjer, inklusive C57BL/6, B6-129 F1 och BALB/c, vanligtvis resulterade i högbeläggningsfärgchimärutveckling hos vissa, men inte alla, avkommor (se figur 4). Metodens begränsning är att de ESC som injiceras i det preimplantatoriska embryot inte alltid kunde bidra till könsceller i en chimär19,20. Germlineöverföring av ESC skulle bero på kvaliteten på varje ESC-klon19. Därför skulle det vara fördelaktigt att utveckla flera ESC-klonlinjer som en säkerhetskopia för stabil chimär musproduktion. Sammanfattningsvis använder de protokoll som presenteras här enkla målvektorer som endast inkluderar varje homologiarm och gen av intresse för KI utan någon läkemedelsresistent kassett. Därför skulle vektorkonstruktionen vara mycket enklare och odlingsperioden skulle kunna förkortas jämfört med den konventionella ESC-inriktningstekniken. Detta skulle hjälpa till att snabbt och underlättande producera olika typer av genetiskt modifierade möss för framtida analys inom life science.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Saki Nishioka i Osaka University, Biotechnology Research and Development (ideell organisation) och Mio Kikuchi och Reiko Sakamoto i Institute of Medical Science, University of Tokyo, för deras utmärkta tekniska hjälp. Detta arbete stöddes av: ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (MEXT) / Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI-bidrag till MI (JP19H05750, JP21H05033) och MO (20H03162); Bidraget från kärnforskningen för evolutionsvetenskap och evolutionsteknik (CREST), Japan Science and Technology Agency (JST) till MI (JPMJCR21N1); Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development till MI (R01HD088412); Bill & Melinda Gates Foundation till MI (Grand Challenges Explorations grant INV-001902); och bidraget för gemensamt forskningsprojekt från Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University till MI och MO.
BALB/c ESC | – | – | ESC developed from BALB/c strain |
Bambanker | Nippon Genetics | CS-02-001 | Cell-freezeing medium. Section 2.6 and elsewhere |
Cas9 Nuclease V3 | IDT | 1081059 | Section 3.2 and elsewhere. |
CHIR99021 | FUJIFILM Wako | 038-23101 | Section 4.3 |
CreERT gene fragment | GeneWiz | Section 1.1. | |
CRISPR-Cas9 crisprRNA | IDT | crisprRNA. Section 3.1 and elsewhere. | |
CRISPR-Cas9 tracrRNA | IDT | 1072534 | tracrRNA. Section 3.1 and elsewhere. |
DMEM | Nacalai | 08458-45 | MEF medium. Section 2.3 and elsewhere |
Duplex buffer | IDT | 1072534 | RNA dilution buffer. Section 3.1 and elsewhere. |
FastGene Gel/PCR Extraction Kit | Nippon Genetics | FG-91302 | Section 1.1 and 1.2. |
GlutaMax | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutatime substrate |
hCG | ASKA Animal Health | Section 6.1. | |
In-Fusion HD Cloning Kit | Clontech | 639648 | DNA cloning kit. Section 1.3 and elsewhere |
JM8.A3 ESC | EuMMCR | – | ESC developed from C57BL/6N strain |
Knock-out DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | Section 4.3 and elsewhere, DMEM-based modified commercial medium. |
KSOM | Merck | MR-121-D | Section 6.3 and 6.9. |
Leukemia inhibitory factor | FUJIFILM Wako | 125-05603 | Section 4.3. No unit concentration data is supplied by the provider. Used 1,000-fold dilution in this protocol. |
Neon Electroporation system | Thermo Fisher | MPK5000 | Section 3.2, 4.5 and elsewhere. The system containes electroporation buffer as well used in section 3.2. |
NucleoSpin Plasmid Transfection-grade | Takara | U0490B | Section 1.6. |
PD0325901 | FUJIFILM Wako | 162-25291 | Section 4.3 |
PMSG | ASKA Animal Health | Section 6.1. | |
Tail lysis buffer | Nacalai | 06169-95 | Section 5.5. |
Trypsin-EDTA | Nacalai | 32777-15 | Section 2.2 and elsewhere |
V6.5 ESC | – | – | ESC developed from B6J-129 F1 strain |
X-ray irradiation device | Hitachi | MBR-1618R-BE | Section 2.6. |