Isolierung von Gentherapievektoren der nächsten Generation durch Engineering, Barcoding und Screening von Kapsidvarianten des Adeno-assoziierten Virus (AAV)
Summary
Generierung von AAV-Peptid-Display-Bibliotheken und anschließende Validierung durch Barcoding von Kandidaten mit neuartigen Eigenschaften für die Erstellung von AAVs der nächsten Generation.
Abstract
Genübertragungsvektoren, die vom Adeno-assoziierten Virus (AAV) abgeleitet sind, sind eines der vielversprechendsten Werkzeuge für die Behandlung genetischer Krankheiten, was durch ermutigende klinische Daten und die Zulassung mehrerer AAV-Gentherapien belegt wird. Zwei Hauptgründe für den Erfolg von AAV-Vektoren sind (i) die vorherige Isolierung verschiedener natürlich vorkommender viraler Serotypen mit unterschiedlichen Eigenschaften und (ii) die anschließende Etablierung leistungsfähiger Technologien für ihr molekulares Engineering und ihre Wiederverwendung im Hochdurchsatz. Das Potenzial dieser Techniken wird durch kürzlich implementierte Strategien zur Barcodierung ausgewählter AAV-Kapside auf DNA- und RNA-Ebene weiter gesteigert, die eine umfassende und parallele In-vivo-Stratifizierung in allen wichtigen Organen und Zelltypen eines einzigen Tieres ermöglichen. Hier stellen wir eine grundlegende Pipeline vor, die diese Reihe komplementärer Wege umfasst und die AAV-Peptidanzeige verwendet, um das vielfältige Arsenal der verfügbaren Kapsid-Engineering-Technologien darzustellen. Dementsprechend beschreiben wir zunächst die entscheidenden Schritte für die Generierung einer AAV-Peptid-Display-Bibliothek für die In-vivo-Auswahl von Kandidaten mit den gewünschten Eigenschaften, gefolgt von einer Demonstration, wie die interessantesten Kapsidvarianten für das sekundäre In-vivo-Screening mit einem Barcode versehen werden können. Als nächstes veranschaulichen wir die Methodik für die Erstellung von Bibliotheken für Next-Generation-Sequencing (NGS), einschließlich Barcode-Amplifikation und Adapterligation, bevor wir mit einem Überblick über die kritischsten Schritte während der NGS-Datenanalyse schließen. Da die hier berichteten Protokolle vielseitig und anpassungsfähig sind, können Forscher sie leicht nutzen, um die optimalen AAV-Kapsidvarianten in ihrem bevorzugten Krankheitsmodell und für Gentherapieanwendungen anzureichern.
Introduction
Gentransfertherapie ist die Einführung von genetischem Material in Zellen, um das zelluläre genetische Material zu reparieren, zu ersetzen oder zu verändern, um Krankheiten vorzubeugen, zu behandeln, zu heilen oder zu verbessern. Der Gentransfer, sowohl de vivo als auch ex vivo, beruht auf unterschiedlichen Verabreichungssystemen, nicht-viralen und viralen. Viren haben sich auf natürliche Weise entwickelt, um ihre Zielzellen effizient zu transduzieren, und können als Liefervektoren verwendet werden. Unter den verschiedenen Arten von viralen Vektoren, die in der Gentherapie eingesetzt werden, werden zunehmend Adeno-assoziierte Viren verwendet, da sie nicht pathogen sind, Sicherheit, geringe Immunogenität und vor allem ihre Fähigkeit, eine langfristige, nicht integrierende Expression aufrechtzuerhalten 1,2,3. Die AAV-Gentherapie hat in den letzten zehn Jahren beachtliche Erfolge erzielt. drei Therapien wurden von der Europäischen Arzneimittel-Agentur und der US-amerikanischen Food and Drug Administration für die Anwendung beim Menschen zugelassen 3,4. Mehrere klinische Studien sind auch im Gange, um eine Vielzahl von Krankheiten wie Hämophilie, Muskel-, Herz- und neurologische Erkrankungen zu behandeln, wie an anderer Stelle beschrieben3. Trotz jahrzehntelanger Fortschritte hat der Bereich der Gentherapie in den letzten Jahren eine Reihe von Rückschlägen erlitten4, vor allem Todesfälle in klinischen Studien5, die aufgrund dosislimitierender Toxizitäten auf Eis gelegt wurden, insbesondere für Gewebe, die massiv sind, wie z. B. Muskeln, oder schwer zu erreichen, wie z. B. Gehirn6.
Die AAV-Vektoren, die derzeit in klinischen Studien verwendet werden, gehören mit wenigen Ausnahmen zu den natürlichen Serotypen1. AAV-Engineering bietet die Möglichkeit, Vektoren mit überlegener Organ- oder Zellspezifität und Effizienz zu entwickeln. In den letzten zwei Jahrzehnten wurden verschiedene Ansätze erfolgreich angewendet, wie z. B. Peptid-Display, Loop-Swap, Kapsid-DNA-Shuffling, fehleranfällige PCR und gezieltes Design, um einzelne AAV-Varianten oder Bibliotheken davon mit unterschiedlichen Eigenschaften zu generieren7. Diese werden dann mehreren Runden der gerichteten Evolution unterzogen, um die darin enthaltenen Varianten mit den gewünschten Eigenschaften auszuwählen, wie an anderer Stelle 1,3 beschrieben. Von allen Kapsid-Evolutionsstrategien sind Peptid-Display-AAV-Bibliotheken aufgrund einiger einzigartiger Eigenschaften am weitesten verbreitet: Sie sind relativ einfach zu generieren und können eine hohe Diversität und eine Hochdurchsatz-Sequenzierung erreichen, die es ermöglicht, ihre Evolution zu verfolgen.
Die ersten erfolgreichen Peptidinsertions-AAV-Bibliotheken wurden vor fast 20 Jahren beschrieben. In einem der ersten konstruierten Perabo et al.8 eine Bibliothek modifizierter AAV2-Kapside, in der ein Pool zufällig generierter Oligonukleotide in ein Plasmid an einer Position eingefügt wurde, die der Aminosäure 587 des VP1-Kapsidproteins entspricht, und zwar in der dreifachen Achse, die aus dem Kapsid herausragt. Unter Verwendung einer Adenovirus-Koinfektion wurde die AAV-Bibliothek durch mehrere Selektionsrunden entwickelt, und es wurde gezeigt, dass die endgültigen Re-Targeting-Varianten in der Lage sind, Zelllinien zu transduzieren, die refraktär auf das elterliche AAV28 sind. Kurz darauf führten Müller et al.9 das zweistufige System für die Bibliotheksproduktion ein, eine deutliche Verbesserung des Protokolls. Zunächst wird die Plasmidbibliothek zusammen mit einem adenoviralen Helferplasmid verwendet, um eine AAV-Bibliothek zu erzeugen, die chimäre Kapside enthält. Diese AAV-Shuttle-Bibliothek wird verwendet, um Zellen mit geringer Infektionsvielfalt (MOI) zu infizieren, mit dem Ziel, ein virales Genom pro Zelle einzuführen. Die Koinfektion mit dem Adenovirus gewährleistet die Produktion von AAVs mit einem übereinstimmenden Genom und Kapsid9. Etwa ein Jahrzehnt später nutzte Dalkara10 die in vivo gerichtete Evolution, um die 7m8-Variante zu schaffen. Diese Variante hat eine 10-Aminosäure-Insertion (LALGETTRPA), von denen drei als Linker fungieren, und zielt nach intravitrealer Injektion effizient auf die äußere Netzhautab 10. Dieses technisch hergestellte Kapsid ist eine außergewöhnliche Erfolgsgeschichte, da es eines der wenigen künstlich hergestellten Kapside ist, das es bisher in die Klinik geschafft hat11.
Einen zweiten Schub erlebte das Feld mit der Einführung von Next-Generation-Sequencing-Techniken (NGS). Zwei Veröffentlichungen von Adachi et al.12 aus dem Jahr 2014 und von Marsic et al.13 aus dem Jahr 2015 zeigten die Leistungsfähigkeit von NGS, die Verteilung von barcodierten AAV-Kapsidbibliotheken mit hoher Genauigkeit zu verfolgen. Einige Jahre später wurde das NGS der barcodierten Regionen an die Peptidinsertionsregion angepasst, um die Kapsidentwicklung zu verfolgen. Körbelin et al.14 führten ein NGS-gesteuertes Screening durch, um ein pulmonales AAV2-basiertes Kapsid zu identifizieren. Die NGS-Analyse half bei der Berechnung von drei Bewertungswerten: dem Anreicherungswert zwischen den Selektionsrunden, dem allgemeinen Spezifitätswert zur Bestimmung der Gewebespezifität und schließlich dem kombinierten Wert14. Das Gradinaru-Labor15 veröffentlichte im selben Jahr das Cre-Rekombinations-basierte AAV-Targeted-Evolutionssystem (CREATE), das eine zelltypspezifische Selektion ermöglicht. In diesem System trägt die Kapsidbibliothek einen Cre-invertierbaren Schalter, da das polyA-Signal von zwei loxP-Stellen flankiert wird. Die AAV-Bibliothek wird dann in Cre-Mäuse injiziert, wobei das polyA-Signal nur in Cre+-Zellen invertiert wird, was die Vorlage für die Bindung eines Reverse-PCR-Primers an den Forward-Primer innerhalb des Kapsidgens liefert. Diese hochspezifische PCR-Rettung ermöglichte die Identifizierung des AAV-PHP. B-Variante, die die Blut-Hirn-Schranke überwinden kann15. Dieses System wurde zu M-CREATE (Multiplexed-CREATE) weiterentwickelt, bei dem NGS und die Generierung synthetischer Bibliotheken in die Pipeline16 integriert wurden.
Eine verbesserte RNA-basierte Version dieses Systems aus dem Maguire-Labor17, iTransduce, ermöglicht die Selektion auf DNA-Ebene von Kapsiden, die Zellen funktionell transduzieren und ihre Genome exprimieren. Das virale Genom der Peptid-Display-Bibliothek besteht aus einem Cre-Gen unter der Kontrolle eines ubiquitären Promotors und dem Kapsidgen unter der Kontrolle des p41-Promotors. Die Bibliothek wird Mäusen injiziert, die eine loxP-STOP-loxP-Kassette stromaufwärts von tdTomato haben. Zellen, die mit AAV-Varianten transduziert wurden, die das virale Genom und damit Cre exprimieren, exprimieren tdTomato und können in Kombination mit Zellmarkern sortiert und selektiert werden17. In ähnlicher Weise stellten Nonnenmacher et al.18 und Tabebordbar et al.19 die Kapsidgenbibliothek unter die Kontrolle gewebespezifischer Promotoren. Nach der Injektion in verschiedene Tiermodelle wurde virale RNA verwendet, um die Kapsidvarianten zu isolieren.
Ein alternativer Ansatz ist die Verwendung von Barcoding zum Markieren von Kapsidbibliotheken. Das Björklund-Labor20 nutzte diesen Ansatz für Barcode-Peptid-Insertionskapsidbibliotheken und entwickelte die barcoded rationale AAV-Vektorevolution (BRAVE). In einem Plasmid wird die Rep2Cap-Kassette neben einem ITR-flankierten, gelb fluoreszierenden Protein (YFP)-exprimierenden, Barcode-markierten Transgen kloniert. Unter Verwendung von loxP-Stellen zwischen dem Ende der Kappe und dem Anfang des Barcodes erzeugt eine in vitro Cre-Rekombination ein Fragment, das klein genug für NGS ist, wodurch die Assoziation der Peptidinsertion mit dem eindeutigen Barcode ermöglicht wird (Look-up-Tabelle, LUT). Die AAV-Produktion wird unter Verwendung der Plasmidbibliothek durchgeführt, und die in der mRNA exprimierten Barcodes werden nach der In-vivo-Anwendung erneut mit NGS20 gescreent. Wenn die Kapsidbibliotheken Varianten des gesamten Kapsidgens enthalten (d. h. gemischte Bibliotheken), muss eine Long-Read-Sequenzierung verwendet werden. Mehrere Gruppen haben Barcodes verwendet, um diese verschiedenen Bibliotheken zu kennzeichnen, was NGS eine höhere Lesetiefe ermöglicht. Das Kay Lab21 markierte sehr unterschiedliche Kapsid-gemischte Bibliotheken mit Barcodes , die dem Cap-PolyA-Signal nachgeschaltet waren. In einem ersten Schritt wurde eine barcodierte Plasmidbibliothek generiert und die gemischte Kapsidgenbibliothek in diese kloniert. Dann wurde eine Kombination aus MiSeq (Short Read, höhere Lesetiefe) und PacBio (Long Read, niedrigere Lesetiefe) NGS sowie Sanger-Sequenzierung verwendet, um ihre LUT21 zu generieren. Im Jahr 2019 beschrieben Ogden und seine Kollegen aus dem Church-Labor22 die AAV2-Kapsideignung für mehrere Funktionen mithilfe von Bibliotheken, die in jeder Position Einzelpunktmutationen, Insertionen und Deletionen aufwiesen, was letztendlich ein maschinengeführtes Design ermöglichte. Für die Generierung der Bibliothek wurden kleinere Fragmente des Kapsidgens synthetisiert, mit einem Barcode markiert, sequenziert und dann in das vollständige Kapsidgen kloniert. Die NGS-Daten wurden verwendet, um eine LUT zu generieren. Die Bibliothek wurde dann nur mit den Barcodes und der Short-Read-Sequenzierung gescreent, was wiederum eine höhere Lesetiefe22 ermöglicht.
Barcode-Bibliotheken wurden überwiegend verwendet, um einen Pool bekannter, natürlicher und technisch entwickelter Varianten nach mehreren Auswahlrunden von Kapsidbibliotheken oder unabhängig von einer Kapsidentwicklungsstudie zu überprüfen. Der Vorteil solcher Bibliotheken ist die Möglichkeit, mehrere Kapside zu screenen und gleichzeitig die Anzahl der Tiere zu reduzieren und die Variation zwischen den Tieren zu minimieren. Die ersten Studien, die diese Technologie in den AAV-Bereich einführten, wurden vor fast einem Jahrzehnt veröffentlicht. Das Nakai-Labor 12 markierte 191 Doppel-Alanin-Mutanten, die die Aminosäuren 356 bis 736 auf dem VP1 von AAV9 mit einem Paar 12-Nukleotid-Barcodes abdecken. Unter Verwendung von NGS wurde die Bibliothek in vivo auf Galaktosebindung und andere Eigenschaften untersucht12. Marsic und Kollegen beschrieben die Bioverteilung von AAV-Varianten mit Hilfe einer Doppel-Barcord-Analyse 1 Jahr später13. Eine neuere Studie an nichtmenschlichen Primaten verglich die Bioverteilung von 29 Kapsiden im Zentralnervensystem auf verschiedenen Verabreichungswegen23. Unser Labor hat kürzlich barcodierte AAV-Bibliotheksbildschirme von 183 Varianten veröffentlicht, die natürliche und technisch hergestellte AAVs enthielten. Diese Screenings auf DNA- und RNA-Ebene führten zur Identifizierung einer hochgradig myotropen AAV-Variante24 bei Mäusen sowie anderen, die eine hohe Zelltypspezifität im Mäusegehirn aufwiesen25.
Hier beschreiben wir die in dieser Arbeit verwendete Methodik und erweitern sie um das Screening von AAV-Peptid-Display-Bibliotheken. Dies umfasst die Generierung von AAV2-Peptid-Display-Bibliotheken, eine digitale Tröpfchen-PCR-Methode (dd-PCR) zur Quantifizierung und schließlich eine NGS-Pipeline zur Analyse der AAV-Varianten, die zum Teil auf der Arbeit von Weinmann und Kollegen24 basiert. Schließlich wird eine Beschreibung der Generierung von barcodierten AAV-Bibliotheken und der NGS-Pipeline bereitgestellt, die in derselben Publikation verwendet wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll werden die Schritte beschrieben, die für das AAV-Kapsid-Engineering für die Peptidanzeige und für das Screening von AAV-Bibliotheken mit Barcodes sowie für die bioinformatische Analyse der Bibliothekszusammensetzung und der Kapsidleistung erforderlich sind. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Schritte, die die bioinformatische Analyse dieser Art von Bibliotheken erleichtern, da die meisten virologischen Laboratorien in ihren Programmierkenntnissen hinterherhinken, um ihren Kenntnissen in mo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.G. freut sich sehr über die Unterstützung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) durch die DFG-Sonderforschungsbereiche SFB1129 (Projektnummer 240245660) und TRR179 (Projektnummer 272983813) sowie durch das Deutsche Zentrum für Infektionsforschung (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).
Materials
| Amplification primer | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | DNA fragment validation |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | DNA fragment validation |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 80204 | DNA/RNA extraction |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | NGS Library preparation |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | NGS Library preparation |
| BC-seq fw: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | ATCACTCTCGGCATGGACGAGC | NGS Library preparation |
| BC-seq rv: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | GGCTGGCAACTAGAAGGCACA | NGS Library preparation |
| β-Mercaptoethanol | Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) | 44-420-3250ML | DNA/RNA extraction |
| BglI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0143 | Digestion of double-stranded insert |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1851196 | dd-PCR cycler |
| dNTPS | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | N0447S | NGS Library preparation |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863024 | dd-PCR supermix |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863005 | dd-PCR droplet generation oil |
| DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864008 | dd-PCR droplet generation cartridge |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863051 | dd-PCR cartridge holder |
| Droplet Generator DG8 Gasket | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863009 | dd-PCR cover for cartridge |
| ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 12001925 | dd-PCR 96-well plate |
| E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells | Lucigen (Middleton, WI, USA) | 60081-1 | Electrocompetent cells |
| Electroporation cuvettes, 1mm | Biozym Scientific (Oldendorf, Germany) | 748050 | Electroporation |
| GAPDH primer/probe mix | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Mm00186825_cn | Taqman qPCR primer |
| Genepulser Xcell | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1652660 | Electroporation |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems (Waltham, MA, USA) | 4368814 | cDNA reverse transcription |
| ITR_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
| ITR_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
| ITR_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR probe |
| Illumina NextSeq 500 system | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | SY-415-1001 | NGS Library sequencing |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)* | Roche AG (Basel, Switzerland) | KK2600 07958919001 | NGS sample prepration |
| MagnaBot 96 Magnetic Separation Device | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | V8151 | Sample prepration for NGS library |
| NanoDrop 2000 spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | ND-2000 | Digestion of double-stranded insert |
| NGS_frw | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC | NGS primer |
| NGS_rev | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | CGC CTT GTG TGT TGA CAT C | NGS primer |
| NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | FC-404-2005 | NGS Library sequencing |
| Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit | NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA) | 9092-256 | NGS Library preparation |
| PX1 Plate Sealer | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814000 | dd-PCR plate sealer |
| Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814040 | dd-PCR sealing foil |
| Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F530S | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
| PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA) | 24765-1G | AAV library preparation |
| ProNex Size-Selective Purification System | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | NG2002 | Sample prepration for NGS library |
| Phusion Hot Start II Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F549L | NGS Library preparation |
| Proteinase K | Roche AG (Basel, Switzerland) | 5963117103 | DNA/RNA extraction |
| pRep2Cap2_PIS | ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab | ||
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864002 | dd-PCR droplet generator |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864003 | dd-PCR droplet analysis |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28306 | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28704 | Plasmid vector purification |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 12162 | Plasmid library DNA preparation |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28104 | Sample prepration for NGS library |
| Qubit fluorometer | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | Q32857 | NGS Library preparation |
| Qubit dsDNA HS | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Q32851 | NGS Library preparation |
| QuantiFast PCR Master Mix | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 1044234 | Taqman qPCR |
| rep_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC | dd-PCR primer |
| rep_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CAATCACGGCGCACATGT | dd-PCR primer |
| rep_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
| RNase-free DNase | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 79254 | DNA/RNA extraction |
| SfiI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0123 | Digestion of vector |
| 5 mm, steel Beads | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 69989 | DNA/RNA extraction |
| TRIMER-oligonucleotides | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Degenerate oligonucleotide |
| T4 Ligase | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | M0202L | Plasmid library ligation |
| TissueLyserLT | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 85600 | DNA/RNA extraction |
| YFP_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GAGCGCACCATCTTCTTCAAG | dd-PCR primer |
| YFP_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | TGTCGCCCTCGAACTTCAC | dd-PCR primer |
| YFP_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped) | Zymo research (Irvine, CA, USA) | D4013 | Vector and Ligation purification |
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