Isolamento dei vettori di terapia genica di prossima generazione attraverso l'ingegneria, il codice a barre e lo screening delle varianti del capside del virus adeno-associato (AAV)
Summary
Generazione della libreria di visualizzazione dei peptidi AAV e successiva validazione attraverso il codice a barre di candidati con nuove proprietà per la creazione di AAV di nuova generazione.
Abstract
I vettori di rilascio genico derivati dal virus adeno-associato (AAV) sono uno degli strumenti più promettenti per il trattamento delle malattie genetiche, evidenziato da dati clinici incoraggianti e dall’approvazione di diverse terapie geniche AAV. Due ragioni principali per il successo dei vettori AAV sono (i) il precedente isolamento di vari sierotipi virali naturali con proprietà distinte e (ii) la successiva creazione di potenti tecnologie per la loro ingegneria molecolare e il loro riutilizzo ad alto rendimento. A rafforzare ulteriormente il potenziale di queste tecniche sono state recentemente implementate strategie per la codifica a barre di capsidi AAV selezionati a livello di DNA e RNA, consentendo la loro stratificazione completa e parallela in vivo in tutti i principali organi e tipi di cellule de un singolo animale. Qui, presentiamo una pipeline di base che comprende questo insieme di strade complementari, utilizzando la visualizzazione del peptide AAV per rappresentare il variegato arsenale di tecnologie di ingegneria del capside disponibili. Di conseguenza, descriviamo prima i passaggi cruciali per la generazione di una libreria di visualizzazione del peptide AAV per la selezione in vivo di candidati con proprietà desiderate, seguita da una dimostrazione di come codificare a barre le varianti di capside più interessanti per lo screening secondario in vivo. Successivamente, esemplificamo la metodologia per la creazione di librerie per il sequenziamento di nuova generazione (NGS), tra cui l’amplificazione dei codici a barre e la legatura degli adattatori, prima di concludere con una panoramica dei passaggi più critici durante l’analisi dei dati NGS. Poiché i protocolli qui riportati sono versatili e adattabili, i ricercatori possono facilmente sfruttarli per arricchire le varianti ottimali di capside AAV nel loro modello di malattia preferito e per applicazioni di terapia genica.
Introduction
La terapia di trasferimento genico è l’introduzione di materiale genetico nelle cellule per riparare, sostituire o alterare il materiale genetico cellulare per prevenire, trattare, curare o migliorare la malattia. Il trasferimento genico, sia de vivo che ex vivo, si basa su diversi sistemi di veicola, non virali e virali. I virus si sono evoluti naturalmente per trasdurre in modo efficiente le loro cellule bersaglio e possono essere utilizzati come vettori di consegna. Tra i diversi tipi di vettori virali impiegati nella terapia genica, i virus adeno-associati sono stati sempre più utilizzati, a causa della loro mancanza di patogenicità, sicurezza, bassa immunogenicità e, soprattutto, la loro capacità di sostenere l’espressione a lungo termine e non integrante 1,2,3. La terapia genica AAV ha prodotto risultati considerevoli negli ultimi dieci anni; tre terapie sono state approvate dall’Agenzia europea per i medicinali e dalla Food and Drug Administration statunitense per l’uso nell’uomo 3,4. Diversi studi clinici sono anche in corso per trattare una varietà di malattie, come l’emofilia, le malattie muscolari, cardiache e neurologiche, come esaminato altrove3. Nonostante decenni di progressi, il campo della terapia genica ha subito una serie di battute d’arresto negli ultimi anni4, soprattutto decessi negli studi clinici5 che sono stati sospesi a causa di tossicità dose-limitanti, in particolare per i tessuti che sono massicci, come i muscoli, o difficili da raggiungere, come il cervello6.
I vettori AAV attualmente utilizzati negli studi clinici appartengono ai sierotipi naturali con poche eccezioni1. L’ingegneria AAV offre l’opportunità di sviluppare vettori con specificità ed efficienza superiori per organi o cellule. Negli ultimi due decenni, diversi approcci sono stati applicati con successo, come la visualizzazione del peptide, il loop-swap, il rimescolamento del DNA del capside, la PCR soggetta a errori e la progettazione mirata, per generare singole varianti AAV o librerie di esse con proprietà diverse7. Questi sono poi sottoposti a più cicli di evoluzione diretta per selezionare le varianti al loro interno con le proprietà desiderate, come esaminato altrove 1,3. Di tutte le strategie di evoluzione del capside, le librerie AAV di visualizzazione dei peptidi sono state le più utilizzate, a causa di alcune proprietà uniche: sono relativamente facili da generare e possono raggiungere un’elevata diversità e un sequenziamento ad alto rendimento, che consente di seguire la loro evoluzione.
Le prime librerie AAV di successo per l’inserimento di peptidi sono state descritte quasi 20 anni fa. In uno dei primi, Perabo et al.8 hanno costruito una libreria di capsidi AAV2 modificati, in cui un pool di oligonucleotidi generati casualmente è stato inserito in un plasmide in una posizione corrispondente all’amminoacido 587 della proteina del capside VP1, nel triplice asse che sporge dal capside. Utilizzando la co-infezione da adenovirus, la libreria AAV è stata evoluta attraverso più cicli di selezione e le varianti finali re-mirate hanno dimostrato di essere in grado di trasdurre linee cellulari refrattarie all’AAV2 8 parentale. Poco dopo, Müller et al.9 introdussero il sistema in due fasi per la produzione di biblioteche, un miglioramento significativo del protocollo. Inizialmente, la libreria plasmidica, insieme a un plasmide aiutante adenovirale, viene utilizzata per produrre una libreria AAV che contiene capsidi chimerici. Questa libreria navetta AAV viene utilizzata per infettare le cellule a bassa molteplicità di infezione (MOI), con l’obiettivo di introdurre un genoma virale per cellula. La co-infezione con adenovirus garantisce la produzione di AAV con un genoma e un capside 9corrispondenti. Circa un decennio dopo, Dalkara10 ha utilizzato l’evoluzione diretta in vivo per creare la variante 7m8. Questa variante ha un’inserzione di 10 aminoacidi (LALGETTRPA), tre dei quali agiscono come linker, e colpisce efficacemente la retina esterna dopo l’iniezione intravitreale10. Questo capside ingegnerizzato è una storia di successo eccezionale, in quanto è uno dei pochi capsidi ingegnerizzati ad arrivare alla clinica finora11.
Il campo ha registrato un secondo impulso con l’introduzione di tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS). Due pubblicazioni di Adachi et al.12 nel 2014 e di Marsic et al.13 nel 2015, hanno mostrato la potenza di NGS per tracciare la distribuzione di librerie di capsidi AAV con codice a barre con elevata precisione. Alcuni anni dopo, l’NGS delle regioni con codice a barre è stato adattato alla regione di inserzione del peptide per seguire l’evoluzione del capside. Körbelin et al.14 hanno eseguito uno screening guidato da NGS per identificare un capside basato su AAV2 mirato ai polmoni. L’analisi NGS ha aiutato a calcolare tre punteggi di valutazione: il punteggio di arricchimento tra i turni di selezione, il punteggio di specificità generale per determinare la specificità del tessuto e infine il punteggio combinato14. Il laboratorio Gradinaru15 ha pubblicato nello stesso anno il sistema di evoluzione mirata AAV basato sulla ricombinazione Cre, che facilita una selezione specifica del tipo di cellula. In questo sistema, la libreria capside trasporta uno switch Cre-invertibile, poiché il segnale polyA è affiancato da due siti loxP. La libreria AAV viene quindi iniettata nei topi Cre, dove il segnale polyA viene invertito solo nelle cellule Cre+, fornendo il modello per il legame di un primer PCR inverso con il primer forward all’interno del gene del capside. Questo salvataggio PCR altamente specifico ha permesso l’identificazione dell’AAV-PHP. Variante B che può attraversare la barriera emato-encefalica15. Questo sistema è stato ulteriormente evoluto in M-CREATE (Multiplexed-CREATE), in cui NGS e generazione di librerie sintetiche sono stati integrati nella pipeline16.
Una versione migliorata basata sull’RNA di questo sistema dal laboratorio Maguire17, iTransduce, consente la selezione a livello del DNA dei capsidi che trasducono funzionalmente le cellule ed esprimono i loro genomi. Il genoma virale della libreria di visualizzazione del peptide comprende un gene Cre sotto il controllo di un promotore ubiquitario e il gene del capside sotto il controllo del promotore p41. La libreria viene iniettata in topi che hanno una cassetta loxP-STOP-loxP a monte di tdTomato. Le cellule trasdotte con varianti AAV che esprimono il genoma virale e quindi Cre esprimono tdTomato e, in combinazione con marcatori cellulari, possono essere selezionatee selezionate 17. Allo stesso modo, Nonnenmacher et al.18 e Tabebordbar et al.19 hanno posto la libreria genica del capside sotto il controllo di promotori tessuto-specifici. Dopo l’iniezione in diversi modelli animali, l’RNA virale è stato utilizzato per isolare le varianti del capside.
Un approccio alternativo consiste nell’utilizzare il codice a barre per contrassegnare le librerie di capside. Il laboratorio Björklund20 ha utilizzato questo approccio alle librerie di capsidi di inserzione di peptidi con codice a barre e ha sviluppato l’evoluzione razionale del vettore AAV con codice a barre (BRAVE). In un plasmide, la cassetta Rep2Cap viene clonata accanto a un transgene con codice a barre che esprime una proteina fluorescente gialla (YFP) con ripetizioni terminali invertite (ITR). Utilizzando siti loxP tra la fine del tappo e l’inizio del codice a barre, una ricombinazione Cre in vitro genera un frammento abbastanza piccolo per NGS, consentendo così l’associazione dell’inserimento del peptide con il codice a barre univoco (look-up table, LUT). La produzione di AAV viene eseguita utilizzando la libreria plasmidica e i codici a barre espressi nell’mRNA vengono sottoposti a screening dopo l’applicazione in vivo , sempre con NGS20. Quando le librerie del capside comprendono varianti dell’intero gene del capside (cioè librerie mescolate), è necessario utilizzare il sequenziamento a lunga lettura. Diversi gruppi hanno utilizzato codici a barre per etichettare queste diverse librerie, il che consente a NGS una maggiore profondità di lettura. Il laboratorio Kay21 ha etichettato librerie mescolate di capside molto diverse con codici a barre a valle del segnale polyA del cappuccio . In una prima fase, è stata generata una libreria di plasmidi con codice a barre e la libreria del gene del capside mescolato è stata clonata in essa. Quindi è stata utilizzata una combinazione di MiSeq (lettura breve, profondità di lettura più elevata) e PacBio (lettura lunga, profondità di lettura inferiore) NGS e sequenziamento Sanger per generare la loro LUT21. Nel 2019, Ogden e colleghi del laboratorio Church22 hanno delineato l’idoneità del capside AAV2 per più funzioni utilizzando librerie che avevano mutazioni a singolo punto, inserzioni e delezioni in ogni posizione, che alla fine hanno permesso la progettazione guidata dalla macchina. Per la generazione della libreria, frammenti più piccoli del gene del capside sono stati sintetizzati, etichettati con un codice a barre, sequenziati di nuova generazione e quindi clonati nel gene del capside completo. I dati NGS sono stati utilizzati per generare una LUT. La libreria è stata quindi vagliata utilizzando solo i codici a barre e il sequenziamento a lettura breve, che a sua volta consente una profondità di lettura più elevata22.
Le librerie con codice a barre sono state utilizzate prevalentemente per vagliare un pool di varianti note, naturali e ingegnerizzate a seguito di diversi cicli di selezione delle librerie di capsidi o indipendentemente da uno studio sull’evoluzione del capside. Il vantaggio di tali librerie è l’opportunità di esaminare più capsidi, riducendo al contempo il numero di animali e minimizzando le variazioni tra gli animali. I primi studi che hanno introdotto questa tecnologia nel campo AAV sono stati pubblicati quasi un decennio fa. Il laboratorio Nakai 12 ha etichettato 191 mutanti doppi dell’alanina che coprono gli amminoacidi da 356 a 736 sul VP1 da AAV9 con una coppia di codici a barre a12 nucleotidi. Utilizzando NGS, la libreria è stata esaminata in vivo per il legame con il galattosio e altre proprietà12. Marsic e colleghi hanno delineato la biodistribuzione delle varianti AAV utilizzando anche un’analisi a doppia barra 1 anno dopo13. Uno studio più recente su primati non umani ha confrontato la biodistribuzione nel sistema nervoso centrale di 29 capsidi utilizzando diverse vie di consegna23. Il nostro laboratorio ha recentemente pubblicato schermi di librerie AAV con codice a barre di 183 varianti che includevano AAV naturali e ingegnerizzati. Questi screening a livello di DNA e RNA hanno portato all’identificazione di una variante AAV altamente miotropica24 nei topi e in altri che mostrano un’elevata specificità di tipo cellulare nel cervello del topo25.
Qui, descriviamo la metodologia utilizzata in questo lavoro e la espandiamo per includere lo screening delle librerie di visualizzazione dei peptidi AAV. Ciò comprende la generazione di librerie di visualizzazione dei peptidi AAV2, un metodo di PCR digitale a goccia (dd-PCR) per la quantificazione e, infine, una pipeline NGS per analizzare le varianti AAV, basata in parte sul lavoro di Weinmann e colleghi24. Infine, viene fornita una descrizione della generazione di librerie AAV con codice a barre e della pipeline NGS utilizzata nella stessa pubblicazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, vengono delineati i passaggi necessari per l’ingegneria del capside AAV di visualizzazione del peptide e per lo screening della libreria AAV con codice a barre, nonché per l’analisi bioinformatica della composizione della libreria e delle prestazioni del capside. Questo protocollo si concentra sui passaggi che facilitano l’analisi bioinformatica di questi tipi di librerie, perché la maggior parte dei laboratori di virologia sono in ritardo nelle capacità di programmazione per abbinare la loro com…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.G. apprezza molto il sostegno della Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) attraverso i centri di ricerca collaborativa DFG SFB1129 (Projektnummer 240245660) e TRR179 (Projektnummer 272983813), nonché del Centro tedesco per la ricerca sulle infezioni (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).
Materials
| Amplification primer | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | DNA fragment validation |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | DNA fragment validation |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 80204 | DNA/RNA extraction |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | NGS Library preparation |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | NGS Library preparation |
| BC-seq fw: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | ATCACTCTCGGCATGGACGAGC | NGS Library preparation |
| BC-seq rv: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | GGCTGGCAACTAGAAGGCACA | NGS Library preparation |
| β-Mercaptoethanol | Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) | 44-420-3250ML | DNA/RNA extraction |
| BglI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0143 | Digestion of double-stranded insert |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1851196 | dd-PCR cycler |
| dNTPS | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | N0447S | NGS Library preparation |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863024 | dd-PCR supermix |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863005 | dd-PCR droplet generation oil |
| DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864008 | dd-PCR droplet generation cartridge |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863051 | dd-PCR cartridge holder |
| Droplet Generator DG8 Gasket | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863009 | dd-PCR cover for cartridge |
| ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 12001925 | dd-PCR 96-well plate |
| E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells | Lucigen (Middleton, WI, USA) | 60081-1 | Electrocompetent cells |
| Electroporation cuvettes, 1mm | Biozym Scientific (Oldendorf, Germany) | 748050 | Electroporation |
| GAPDH primer/probe mix | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Mm00186825_cn | Taqman qPCR primer |
| Genepulser Xcell | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1652660 | Electroporation |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems (Waltham, MA, USA) | 4368814 | cDNA reverse transcription |
| ITR_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
| ITR_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
| ITR_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR probe |
| Illumina NextSeq 500 system | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | SY-415-1001 | NGS Library sequencing |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)* | Roche AG (Basel, Switzerland) | KK2600 07958919001 | NGS sample prepration |
| MagnaBot 96 Magnetic Separation Device | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | V8151 | Sample prepration for NGS library |
| NanoDrop 2000 spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | ND-2000 | Digestion of double-stranded insert |
| NGS_frw | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC | NGS primer |
| NGS_rev | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | CGC CTT GTG TGT TGA CAT C | NGS primer |
| NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | FC-404-2005 | NGS Library sequencing |
| Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit | NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA) | 9092-256 | NGS Library preparation |
| PX1 Plate Sealer | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814000 | dd-PCR plate sealer |
| Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814040 | dd-PCR sealing foil |
| Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F530S | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
| PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA) | 24765-1G | AAV library preparation |
| ProNex Size-Selective Purification System | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | NG2002 | Sample prepration for NGS library |
| Phusion Hot Start II Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F549L | NGS Library preparation |
| Proteinase K | Roche AG (Basel, Switzerland) | 5963117103 | DNA/RNA extraction |
| pRep2Cap2_PIS | ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab | ||
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864002 | dd-PCR droplet generator |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864003 | dd-PCR droplet analysis |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28306 | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28704 | Plasmid vector purification |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 12162 | Plasmid library DNA preparation |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28104 | Sample prepration for NGS library |
| Qubit fluorometer | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | Q32857 | NGS Library preparation |
| Qubit dsDNA HS | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Q32851 | NGS Library preparation |
| QuantiFast PCR Master Mix | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 1044234 | Taqman qPCR |
| rep_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC | dd-PCR primer |
| rep_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CAATCACGGCGCACATGT | dd-PCR primer |
| rep_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
| RNase-free DNase | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 79254 | DNA/RNA extraction |
| SfiI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0123 | Digestion of vector |
| 5 mm, steel Beads | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 69989 | DNA/RNA extraction |
| TRIMER-oligonucleotides | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Degenerate oligonucleotide |
| T4 Ligase | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | M0202L | Plasmid library ligation |
| TissueLyserLT | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 85600 | DNA/RNA extraction |
| YFP_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GAGCGCACCATCTTCTTCAAG | dd-PCR primer |
| YFP_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | TGTCGCCCTCGAACTTCAC | dd-PCR primer |
| YFP_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped) | Zymo research (Irvine, CA, USA) | D4013 | Vector and Ligation purification |
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