Seguimiento del tráfico de células T inducido por anticuerpos biespecíficos utilizando células T humanas transducidas por luciferasa
Summary
Aquí, describimos un método para transducir células T humanas con luciferasa para facilitar el seguimiento in vivo del tráfico de células T inducido por anticuerpos biespecíficos a tumores en estudios para evaluar la eficacia antitumoral y el mecanismo de anticuerpos biespecíficos que involucran a las células T.
Abstract
Los anticuerpos biespecíficos que se involucran con células T (T-BSABS) se encuentran en varias etapas de desarrollo preclínico y pruebas clínicas para tumores sólidos. Factores como la valencia, la disposición espacial, la distancia entre dominios y las mutaciones Fc afectan la eficacia antitumoral de estas terapias, comúnmente al influir en la orientación de las células T a los tumores, lo que sigue siendo un desafío importante. Aquí, describimos un método para transducir células T humanas activadas con luciferasa, lo que permite el seguimiento in vivo de las células T durante los estudios de terapia T-BsAb. La capacidad de los T-BsAbs para redirigir las células T a los tumores se puede evaluar cuantitativamente en múltiples puntos temporales durante el tratamiento, lo que permite a los investigadores correlacionar la eficacia antitumoral de los T-BsAbs y otras intervenciones con la persistencia de las células T en los tumores. Este método alivia la necesidad de sacrificar animales durante el tratamiento para evaluar histológicamente la infiltración de células T y puede repetirse en múltiples puntos de tiempo para determinar la cinética del tráfico de células T durante y después del tratamiento.
Introduction
Los anticuerpos biespecíficos que se involucran con células T (T-BsAbs) son anticuerpos diseñados que se usan para proporcionar especificidad artificial a las células T policlonales al involucrar a las células T a través de un brazo de unión y un antígeno tumoral a través de otro brazo de unión. Esta tecnología se ha aplicado con éxito a cánceres hematológicos (blinatumomab1 dirigido a CD19), y numerosos T-BsAbs están en desarrollo preclínico y clínico para una variedad de tumores sólidos también2. Los T-BsAbs involucran a las células T policlonales de una manera independiente del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y, por lo tanto, incluso los tumores que regulan negativamente los antígenos leucocitarios humanos (HLA) son susceptibles a este tipo de terapia 3,4. Los T-BsAbs se han desarrollado en docenas de formatos diferentes, con diferencias en la valencia y disposición espacial de los brazos de unión de células T y tumores, distancias entre dominios y la inclusión de un dominio Fc, que afecta la vida media y puede inducir funciones efectoras si están presentes5. Trabajos previos en nuestro laboratorio han demostrado que estos factores afectan significativamente la eficacia antitumoral de T-BsAbs, con diferencias de hasta 1.000 veces en la potencia6. A través de este trabajo, identificamos el formato IgG-[L]-scFv como la plataforma ideal para T-BsAbs (consulte la sección Resultados representativos para obtener más detalles sobre los formatos T-BsAb), y hemos aplicado esta plataforma a objetivos que incluyen GD2 (neuroblastoma), HER2 (cáncer de mama y osteosarcoma), GPA33 (cáncer colorrectal), STEAP1 (sarcoma de Ewing), CD19 (neoplasias malignas de células B) y CD33 (neoplasias malignas de células B)7, 8,9,10,11,12,13.
Uno de los principales desafíos para implementar con éxito la terapia T-BsAb en tumores sólidos es superar un microambiente tumoral inmunosupresor (TME) para conducir el tráfico de células T a los tumores14. Los factores que afectan la eficacia de T-BsAb descritos anteriormente tienen un impacto significativo en la capacidad de T-BsAbs para inducir eficazmente la orientación de células T a los tumores, pero este efecto es difícil de evaluar en un sistema in vivo en tiempo real. Este manuscrito proporciona una descripción detallada del uso de células T transducidas por luciferasa en estudios preclínicos de T-BsAbs para evaluar el tráfico de células T a diversos tejidos en modelos experimentales de ratones inmunocomprometidos durante el tratamiento. El objetivo general de este método es proporcionar un medio para evaluar la infiltración de células T en tumores y otros tejidos, así como información en tiempo real sobre la cinética y persistencia de las células T, sin la necesidad de sacrificar animales durante el tratamiento. Para el creciente número de investigadores que se centran en las inmunoterapias celulares, la capacidad de rastrear las células T in vivo en modelos animales preclínicos es crucial. Nuestro objetivo es proporcionar una descripción exhaustiva y detallada del método que hemos empleado para rastrear las células T transducidas por luciferasa para permitir que otros investigadores puedan replicar fácilmente esta técnica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Si bien el Blinatumomab T-BsAb ha sido aprobado para neoplasias hematológicas CD19 positivas, la implementación exitosa de T-BsAbs en tumores sólidos ha demostrado ser mucho más difícil. El catumaxomab, un T-BsAb dirigido contra la molécula de adhesión de células epiteliales (EPCAM), fue aprobado para el tratamiento de la ascitis maligna en pacientes con cáncer de ovario, pero la producción del fármaco se detuvo posteriormente por razones comerciales19. No se han aprobado otros T-BsAb p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Dr. Vladimir Ponomarev por compartir las construcciones de luciferasa utilizadas en los experimentos descritos en la sección de resultados representativos de este artículo.
Materials
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7030-10G | |
| CD3/CD28 beads | Gibco (ThermoFisher) | 11161D | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DMEM | Gibco (ThermoFisher) | 11965092 | |
| DNA in vitro transfection reagent (polyjet) | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| FBS | Gibco (ThermoFisher) | 10437028 | |
| Gag/pol plasmid | Addgene | 14887 | |
| GFP plasmid | Addgene | 11150-DNA.cg | |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco (ThermoFisher) | 15140122 | |
| Recombinant human IL-2 | R&D Systems | 202-IL-010/CF | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Trypsin | Gibco (ThermoFisher) | 25-300-120 | |
| VSV-G plasmid | Addgene | 8454 |
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