Os microcosmos de composto trazem a diversidade microbiana encontrada na natureza para o laboratório para facilitar a pesquisa do microbioma em Caenorhabditis elegans. Aqui são fornecidos protocolos para a criação de experimentos de microcosmos, com os experimentos demonstrando a capacidade de modular a diversidade microbiana ambiental para explorar as relações entre a diversidade microbiana ambiental e a composição do microbioma intestinal do verme.
O nematoide Caenorhabditis elegans está emergindo como um modelo útil para estudar os mecanismos moleculares subjacentes às interações entre hospedeiros e seus microbiomas intestinais. Embora experimentos com bactérias bem caracterizadas ou comunidades bacterianas definidas possam facilitar a análise de mecanismos moleculares, estudar nematoides em seu contexto microbiano natural é essencial para explorar a diversidade de tais mecanismos. Ao mesmo tempo, o isolamento de vermes da natureza nem sempre é viável e, mesmo quando possível, a amostragem da natureza restringe o uso do kit de ferramentas genéticas de outra forma disponível para a pesquisa de C. elegans. O protocolo a seguir descreve um método para estudos de microbioma utilizando microcosmos de composto para o crescimento em laboratório em ambientes microbianamente diversos e naturais.
O solo de origem local pode ser enriquecido com produtos para diversificar as comunidades microbianas nas quais os vermes são criados e dos quais são colhidos, lavados e esterilizados superficialmente para análises subsequentes. Experimentos representativos demonstram a capacidade de modular a comunidade microbiana em um solo comum, enriquecendo-o com diferentes produtos e demonstram ainda que os vermes criados nesses ambientes distintos montam microbiomas intestinais semelhantes distintos de seus respectivos ambientes, apoiando a noção de um microbioma intestinal central específico da espécie. No geral, os microcosmos de composto fornecem ambientes naturais em laboratório para a pesquisa do microbioma como uma alternativa às comunidades microbianas sintéticas ou ao isolamento de nematoides selvagens.
O nematoide Caenorhabditis elegans está emergindo como um modelo útil para o estudo das interações entre hospedeiros e seus microbiomas intestinais 1,2. Como modelo, oferece várias vantagens. Em primeiro lugar, os animais livres de germes ou gnotobióticos são fáceis de obter e manter; A água sanitária pode ser usada para matar vermes gravídicos e micróbios associados, deixando seus ovos resistentes à água sanitária ilesos para crescer como populações sincronizadas com a idade que podem ser colonizadas por bactérias de interesse 3,4. Além disso, quando cultivada na presença de bactérias, C. elegans, um bacterívoro, ingere as bactérias encontradas, com espécies suscetíveis digeridas ou excretadas, enquanto espécies resistentes e persistentes colonizam de forma estável o intestino do verme. Além disso, C. elegans é principalmente hermafrodita, produzindo populações de progênie geneticamente idêntica, o que reduz a variação genética confusa. Juntamente com a disponibilidade de cepas de vermes mutantes e transgênicos, o trabalho com C. elegans oferece aos pesquisadores um modelo gnotobiótico e geneticamente tratável para investigar os fundamentos moleculares das interações hospedeiro-micróbio 5,6,7,8.
Embora experimentos com bactérias bem caracterizadas possam facilitar a análise de mecanismos moleculares, identificar e estudar as bactérias com as quais os vermes interagem na natureza são essenciais para explorar a diversidade de tais mecanismos, desvendar o contexto natural para sua função e entender as forças seletivas que moldaram sua evolução. Fora do laboratório, C. elegans é encontrada globalmente em climas temperados úmidos, onde se acredita que as populações passem por um ciclo de vida de “boom-and-bust”, caracterizado pelo rápido crescimento populacional quando os recursos são abundantes, seguido por uma mudança de desenvolvimento para dauers pioneiros e tolerantes ao estresse quando os recursos estão esgotados9. Embora considerado um nematoide do solo, as populações de C. elegans em proliferação selvagem são mais comumente encontradas alimentando-se de material orgânico em decomposição, como flores ou frutos em decomposição, onde as populações bacterianas são abundantes e diversificadas.
Estudos do microbioma intestinal em nematoides isolados da natureza identificaram comunidades bacterianas diversas, porémcaracterísticas10,11, cuja composição foi ainda mais apoiada por estudos realizados com vermes criados em ambientes de microcosmos semelhantes aos naturais12,13. Juntos, tais estudos permitiram o delineamento de um microbioma intestinal de vermes centrais2. Considerando que a amostragem de populações de C. elegans na natureza representa o exame mais direto das interações verme-micróbio natural, não é viável em todos os lugares e a qualquer momento, pois é limitada a regiões e estações com ampla precipitação10,11. Alternativamente, em vez de isolar vermes de seu habitat natural, experimentos usando microcosmos trazem o habitat natural para o laboratório 6,8,12,13,14,15. Os ambientes de microcosmos são preparados a partir do solo compostado com várias frutas ou legumes, o que permite uma maior diversificação da comunidade de solo inicial. Eles oferecem métodos experimentais tratáveis que combinam a diversidade microbiana e o ambiente tridimensional do solo selvagem com as vantagens experimentais de uma instalação de laboratório controlada e cepas de vermes geneticamente definidas. O protocolo abaixo detalha as etapas envolvidas no trabalho com microcosmos de composto, demonstrando seu uso na compreensão da montagem de um microbioma intestinal característico de diversos ambientes.
O protocolo aqui apresentado descreve um método para estudar o microbioma intestinal de nematoides criados em ambientes naturais, oferecendo uma abordagem alternativa para o isolamento de vermes da natureza ou para criá-los em comunidades sintéticas.
As milhares de espécies bacterianas potenciais capturadas no experimento representativo do microcosmo refletem a diversidade microbiana com a qual os vermes evoluíram e demonstram a capacidade do pipeline de microcosmos de combinar as vantagens de trabalhar com um organismo hospedeiro modelo e as de trabalhar com comunidades microbianas naturais e diversas.
Os resultados representativos demonstram que o enriquecimento de um solo comum com diferentes tipos de produtos modula a diversidade microbiana ambiental, destacando a gama de diversidade microbiana disponível para exploração utilizando esse gasoduto. A escolha do produto não é particularmente importante. Trabalhos anteriores usaram bananas, maçãs, laranjas, morangos, folhas de chá verde e batatas para enriquecer o solo, resultando em vermes semelhantes aumentando a eficiência. Produtos mistos também têm sido utilizados de forma eficaz. A principal característica é que diferentes produtos diversificarão um determinado solo de maneiras distintas.
Apesar da ampla variação na diversidade microbiana ambiental, os microbiomas intestinais dos vermes variam consideravelmente menos, recapitulando a importância do nicho intestinal do verme e da filtragem do hospedeiro para a montagem de um microbioma intestinal central distinto do ambiente do solo13. Esse padrão é melhor observado com a análise ponderada UniFrac PCoA, demonstrando que as diferenças entre o solo ambiental e os microbiomas intestinais de vermes derivam principalmente de diferenças na abundância relativa de táxons-chave.
Embora o protocolo descrito aqui se concentre na colheita de vermes para sequenciamento 16S, os microcosmos podem ser usados para explorar questões adicionais de interesse. Por exemplo, vermes colhidos de microcosmos podem ser posteriormente examinados quanto ao efeito de um microbioma intestinal diversificado na resistência do hospedeiro a várias condições adversas, incluindo patógenos ou toxinas. Alternativamente, novas espécies e cepas bacterianas podem ser isoladas e cultivadas a partir de vermes colhidos no solo, expandindo a diversidade taxonômica e funcional de bactérias disponíveis para realizar experimentos.
Enquanto os métodos de pesquisa em ambientes de laboratório buscam consistência e reprodutibilidade, o trabalho com microcosmos aproveita a variação natural para explorar as interações hospedeiro-micróbio em um contexto natural. No entanto, essa variação também apresenta alguns desafios. Alguns solos que incluem altos níveis de invertebrados endógenos podem exigir etapas adicionais de centrifugação, filtração e exame para eliminar efetivamente organismos indesejados da preparação do microcosmo. Além disso, a baixa abundância microbiana no solo pode induzir a formação indesejada de dauer em populações de vermes, exigindo um aumento no extrato microbiano ou enriquecendo o solo com uma maior quantidade de produtos. Com cada experimento de microcosmo realizado, os pesquisadores continuam a explorar toda a diversidade taxonômica e funcional fornecida pela natureza, permitindo a descoberta de novos táxons microbianos e habilidades funcionais que vão desde a resistência à infecção até a proteção contra xenobióticos ambientais.
The authors have nothing to disclose.
O trabalho descrito neste manuscrito foi apoiado pelos subsídios do NIH R01OD024780 e R01AG061302. K.T. foi ainda apoiado por uma bolsa de pesquisa de graduação de verão da Universidade da Califórnia, Berkeley, financiada pela Fundação Rose Hills. Os desenhos animados da Figura 1 foram obtidos a partir de BioRender.com.
AMPure XP Reagent, 60 mL | Beckman Coulter | A63881 | Supplementary File Step 1.3 |
Bleach (Sodium Hypochlorite) | Sigma-Aldrich | 7681-52-9 | Step 6.5 |
DNeasy PowerSoil Pro Kit | Qiagen | 47016 | Step 7 DNA extractions |
dNTP set 10 mM | Invitrogen | 18427013 | Supplementary Step 1.2 |
Easypet 3 Serological Pipette Controller | Eppendorf | 4430000018 | Used to remove supernatant when specified |
Greiner Bio-One 25 mL Sterile Serological Pipets | Fisher Scientific | 07-000-368 | Used to remove supernatant when specified |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | Used to make M9 |
Levamisole Hydrochloride | Fisher Scientific | AC187870100 | Step 6.4 |
M9 Minimal Media Solution | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | Used to make M9 |
MiniSeq High Output Reagent Kit (150 cycles) | Illumina | FC-420-1002 | Supplementary Step 1.7 |
MiniSeq System | Illumina | SY-420-1001 | Commercial sequencer used; Supplementary Step 1.7 |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | Used to make M9 |
NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Used to make M9 |
Nematode Growth Media (NGM) | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
Nextera XT DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-131-1096 | Library prep kit used; Supplementary Step 1.4 |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Supplementary Step 1.7 |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | Supplementary Step 1.2 |
PowerLyzer 24 Homogenizer (110/220 V) | Qiagen | 13155 | Step 7.3 |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | Used to prepare M9+T |
Zirconia/Silica Beads 1.0 mm diameter | Fisher Scientific | NC9847287 | Step 7.1 |