Denne protokol indeholder metoder til generering af 3D-manipuleret hjerte- og skeletmuskelvæv og beskriver deres anvendelse i prækliniske lægemiddelscreeningsmetoder. De beskrevne metoder anvender et magnetisk sensorsystem til at lette den samtidige vurdering af 24 væv parallelt.
Nøjagtig modellering af sunde og sygdomstilstande in vitro er afgørende for udviklingen af nye behandlingsstrategier og terapi. For hjerte- og skeletmuskelsygdomme udgør kontraktil kraft og kinetik nøglemålinger til vurdering af muskelfunktion. Nye og forbedrede metoder til generering af manipulerede muskelvæv (EMT’er) fra inducerede pluripotente stamceller har gjort in vitro-sygdomsmodellering mere pålidelig for kontraktilt væv; Imidlertid er reproducerbart fremstilling af væv fra suspenderede cellekulturer og måling af deres kontraktilitet udfordrende. Sådanne teknikker er ofte plaget af høje fejlrater og kræver kompleks instrumentering og tilpassede dataanalyserutiner. En ny platform og enhed, der bruger 3D EMT’er i forbindelse med en etiketfri, meget parallel og automatiseringsvenlig kontraktilitetsanalyse, omgår mange af disse forhindringer. Platformen muliggør let og reproducerbar fremstilling af 3D EMT’er ved hjælp af stort set enhver cellekilde. Vævskontraktilitet måles derefter via et instrument, der samtidig måler 24 væv uden behov for komplekse softwareanalyserutiner. Instrumentet kan pålideligt måle mikronewtonændringer i kraft, hvilket muliggør dosisafhængig sammensat screening for at måle effekten af et lægemiddel eller terapeutisk på kontraktil output. Konstruerede væv fremstillet med denne enhed er fuldt funktionelle, genererer træk og tetaniske sammentrækninger ved elektrisk stimulering og kan analyseres i længderetningen i kultur over uger eller måneder. Her viser vi data fra hjertemuskel-EMT’er under akut og kronisk dosering med kendte toksiske stoffer, herunder et lægemiddel (BMS-986094), der blev trukket fra kliniske forsøg efter patientdødsfald på grund af uventet kardiotoksicitet. Ændret skeletmuskelfunktion i manipuleret væv som reaktion på behandling med en myosinhæmmer præsenteres også. Denne platform gør det muligt for forskeren at integrere komplekse, informationsrige bioengineered modelsystemer i deres lægemiddelopdagelsesworkflow med minimal yderligere træning eller færdigheder, der kræves.
Inducerede pluripotente stamcellemodeller (iPSC) bliver i stigende grad nøgleaktører i den prækliniske pipeline for terapeutisk opdagelse og udvikling samt grundlæggende biologisk forskning og sygdomsmodellering 1,2,3,4,5. Kontraktilt væv, såsom hjerte- og skeletmuskulatur afledt af iPSC’er, har et stort potentiale for at forbedre den prædiktive effekt af humane in vitro-undersøgelser, da direkte vurdering af muskelkontraktil kraft og kinetik er kvantitative målinger til undersøgelse af den samlede vævsfunktion 4,6,7,8. Typisk er målinger af kontraktil kraft opnået enten indirekte ved optisk sporing af substratafbøjning 9,10 eller direkte ved fastgørelse af celler/væv til en krafttransducer4,11,12. Selvom disse metoder er nøjagtige, er de i sagens natur lave gennemløb og kræver typisk højt kvalificerede operatører til at indsamle og analysere data.
Tidligere arbejde har vist, at magnetfeltregistrering omgår disse forhindringer og giver en alternativ metode til at vurdere manipuleret muskelfunktion samtidigt på tværs af flere vævskonstruktioner13. Mantarray (Magnetometric Analyzer for eNgineered Tissue ARRAY) 3D Contractility Platform bygger på denne teknologi ved hjælp af en enhed, der er i stand til at måle kontraktiliteten af konstruerede muskelvæv på en meget parallel måde, der udnytter kompleksiteten af 3D-cellulære modeller med screening med højere gennemstrømning14. Platformen muliggør etiketfri, kvantitativ, realtidsovervågning af kontraktil funktion i hjerte- og skeletmuskelvæv i eller uden for en standard cellekulturinkubator, hvilket eliminerer behovet for optisk baseret kontraktil billeddannelse og analyse. Denne teknologi letter direkte sammenligning af sunde og syge cellelinjer og muliggør måling af et lægemiddels virkning på kontraktilt væv, etablering af kvantificerbare, in vitro, sikkerheds- og effektivitetsdata for nye og eksisterende terapeutiske forbindelser.
Konstrueret 3D-muskelvæv kan fremstilles mellem to stolper på en meget reproducerbar måde ved hjælp af Mantarray-forbrugspladen, 24-brønds støbeplade (figur 1). Den ene stolpe er stiv, mens den anden stolpe er fleksibel og indeholder en lille magnet. Når vævskonstruktionen trækker sig sammen, fortrænger den den fleksible stolpe og den indlejrede magnet. EMT-pladen er placeret inde i instrumentet, og postforskydning måles via en række magnetiske sensorer på et printkort under pladeholderen. De målte ændringer i magnetfeltet omdannes til absolut kontraktil kraft ved hjælp af en matematisk algoritme. Instrumentet anvender hurtige dataprøvetagningshastigheder for at muliggøre indsamling af detaljerede oplysninger om funktionskapacitet og modenhed af den eller de celletyper, der analyseres, herunder sammentrækningsfrekvens, hastighed og henfaldstid. Disse funktionelle målinger kan opnås på tværs af alle 24 brønde samtidigt med den magnetiske sensorplatform eller individuelt og sekventielt ved hjælp af traditionelle optiske metoder.
Denne undersøgelse beskriver en meget reproducerbar metode til konstruktion af 3D-skeletmuskulatur og hjertemikrovæv i en fibrinbaseret hydrogel. Under en kort 80-minutters reaktion katalyserer thrombin omdannelsen af fibrinogen til fibrin, hvilket giver et stillads for muskelceller at udvikle sig i suspenderet kultur15. Stromaceller hjælper med at ombygge matrixen, og væv bliver kontraktile, da muskelceller danner et syncytium i hydrogelen. Kontraktiliteten af disse væv blev analyseret ved hjælp af den magnetiske sensing tilgang, både før og efter sammensat eksponering, validerer denne modalitet til brug i dosis-respons lægemiddelundersøgelser. Primære humane myoblaster fra en sund donorbiopsi blev opnået kommercielt og dyrket i 2D i henhold til sælgerens protokoller. Celler blev udvidet ved hjælp af et skeletmuskelvækstmedium gennem tre passager for at generere tilstrækkelige cellenumre til at fremstille 3D-væv. Stromaceller og hiPSC-afledte kardiomyocytter blev dyrket i henhold til sælgerens protokol i 3 dage for at muliggøre genopretning fra kryopræservering, før celler blev kastet i væv. Der gives repræsentative resultater, der illustrerer de typer datasæt, der kan indsamles ved hjælp af den magnetiske sensorplatform. Almindelige faldgruber forbundet med generering af manipuleret væv ved hjælp af disse metoder behandles også.
Denne undersøgelse beskriver metoder til generering af 3D-konstrueret hjerte- og skeletmuskelvæv i et 24-brønds forbrugsstof. Ved at følge disse metoder er det muligt konsekvent at opnå et komplet udvalg af 24 væv uden støbefejl til efterfølgende lægemiddelscreening. Kritiske overvejelser for at opnå et sådant resultat er at sikre, at alle trin under støbning udføres på is for at forhindre for tidlig polymerisation af hydrogelerne, fjernelse af celledissociationsreagens inden vævsstøbning, grundig blanding af celle- og hydrogelsuspensionen for hvert væv, udskiftning af pipettespidser mellem væv og anvendelse af varmeinaktiveret FBS (hvis det overhovedet anvendes). Det er også vigtigt at sikre, at stolpegitteret ikke flyttes, når støbningen starter og overføres forsigtigt, når hydrogeler er dannet.
Større ændringer omfatter brugen af forskellige celletyper til at opnå hjerte versus skeletale EMT’er og doping af hydrogeler med variable koncentrationer af kældermembranproteiner for at fremme cellulær modning og vævsstabilitet. De gavnlige virkninger af sådan doping skal testes fra sag til sag, men har vist sig at forbedre funktionelle resultater og vævets levetid under visse omstændigheder14,16,22. Det er også bemærkelsesværdigt, at de anførte celletætheder er vejledende og muligvis skal optimeres til forskellige cellelinjer. Alternative hydrogelsammensætninger kan også overvejes som et middel til at ændre de strukturelle og funktionelle egenskaber af de opnåede EMT’er23,24,25. Det indfødte muskelmikromiljø indeholder også understøttende celletyper til fremme af vaskularisering, innervering og matrixaflejring for at understøtte myocytter i form og funktion26,27. Mens systemet beskrevet her i øjeblikket inkorporerer fibroblaster i 3D-hjertevæv, kan yderligere celletyper skabe en mere fysiologisk relevant model til at studere sikkerheden og effekten af terapeutiske forbindelser in vitro. Tidligere er en række understøttende celletyper med succes blevet integreret i 3D-manipulerede væv, der præsenterer en spændende skabelon til fremtidig undersøgelse ved hjælp af den magnetiske sensing kontraktilitetsplatform28,29,30.
Fejlfinding for denne protokol centrerer sig om dannelsen af upålidelige eller inkonsekvente væv under støbeprocessen. Der skal udvises forsigtighed for at undgå bobledannelse i hydrogelerne, når de støbes, samtidig med at cellerne stadig lettes jævn fordeling under blanding. Optimeringseksperimenter vil sandsynligvis være nødvendige for hver ny celletype for at identificere ideelle celletætheder, celleforhold og matrixsammensætning.
En væsentlig begrænsning for denne teknik er det betydelige antal celler, der kræves for at etablere en fuld plade på 24 EMT’er. For de data, der præsenteres her, blev 15 millioner kardiomyocytter og 18 millioner skeletmyoblaster brugt pr. Plade. Visse forskere har muligvis ikke adgang til så store puljer af cellulært materiale, hvilket kan hæmme deres evne til at bruge denne platform i fuldt omfang. Hvis slutbrugerne ikke har adgang til magnetisk sensorhardware, skal målinger af efterbøjninger udføres optisk, hvilket reducerer gennemstrømningen betydeligt og forhindrer samtidig registrering af muskelsammentrækninger på tværs af flere brønde. Mantarray-hardwaren overvinder imidlertid disse begrænsninger for at tilbyde det første kommercielle system, der er i stand til kontinuerlig, ikke-invasiv analyse af EMT-sammentrækning samtidigt på tværs af flere konstruktioner.
Magnetisk sensing på tværs af 24 brønde letter langsgående undersøgelser af EMT-funktionel udvikling i realtid og muliggør nøjagtig måling af akutte reaktioner på kemisk, miljømæssig eller genetisk manipulation. Mens magnetisk sensing har flere fordele, såsom samtidig måling på tværs af flere væv, og ikke kræver kompliceret dataanalyse, muliggør optiske detektionsmetoder samtidig måling af fysiologiske målinger såsom calciumflux eller spændingskortlægning. Datasæt som dem, der er illustreret i resultatafsnittet, viser imidlertid bredden af applikationer, som denne teknologi har i lægemiddeludviklingsområdet. I betragtning af at få assays på markedet tilbyder midlerne til at udføre en direkte vurdering af kontraktil output i konstruerede muskler, har disse metoder potentialet til at revolutionere den prækliniske udviklingspipeline.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist støttet af finansiering fra Food and Drug Administration (U01 FD006676-01 tildelt Health and Environmental Sciences Institute) og af finansiering fra National Institutes of Health (HL151094 til Dr. Geisse). Vi takker Dr. Alec S. T. Smith for hans hjælp med udarbejdelsen af dette manuskript.
100 µm cell strainer | CELLTREAT | 229485 | |
100 mm cell culture dish | ThermoFisher | 150466 | |
50 mL Steriflip filter | MilliporeSigma | SCGP00525 | |
500 mL filter flask | MilliporeSigma | S2GVU05RE | |
6-aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
B27 | Gibco | 17504044 | |
Cardiosight Maintenance Medium | NEXEL | CM-002A | |
Cardiosight Plating Medium | NEXEL | CM-020A | |
C-Pace EM stimulator | IonOptix | EM | |
Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit | Primary – DIFF | ||
Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit | Curi Bio | Primary – MAINT | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX | Gibco | 10566-016 | |
Dnase | Sigma | 11284932001 | |
DPBS | Gibco | 14190-250 | |
Dystrophin antibody | Abcam | ab154168 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | 10082147 | Must be heat-inactivated |
Fibrinogen (Bovine) | Sigma | E8630 | |
Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
Ham's F10 | Gibco | 11550043 | |
Hemacytometer | Sigma | Z359629 | |
HS-27A Fibroblasts | ATCC | CRL-2496 | |
Human Skeletal Muscle Myoblasts | Lonza | CC-2580 | |
Luer Lock 0.2 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
Luer Lock 10 mL syringe | BH Supplies | BH10LL | |
Mantarray Instrument | Curi Bio | MANTA-24-B1 | System |
Mantarray Plate Kits | Curi Bio | MA-24-SKM-5 | Pack of 5 kits |
Mantarray stimulation lid | Curi Bio | EM | |
Matrigel (ECM) | Corning | 356231 | |
Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
Optical Microscope | Nikon Ti2E | MEA54000 | |
Pan Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF-20 | |
Poly(ethyleneimine) | Sigma | P3143 | |
ROCK inhibitor | StemCell Technologies | Y-27632 | |
RPMI | Gibco | 11875-093 | |
Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2) | Lonza | CC-3245 | |
Standard 24-well plates | Greiner | M8812 | Other manufacturer's plates will not fit |
Standard 6-well plates | ThermoFisher | 140675 | |
Stromal medium (DMEM + 20% FBS) | |||
T175 Filter Flask | ThermoFisher | 159910 | |
T225 Filter Flask | ThermoFisher | 159934 | |
Thrombin | Sigma | T4648 | |
Trypan Blue solution, 0.4% | ThermoFisher | 15250061 | |
TrypLE Select Enzyme (10x) | Thermo Scientific | A1217702 | |
TrypLE Select Enzyme (1x) | Thermo Scientific | 12563011 |