Detta protokoll tillhandahåller metoder för att generera 3D-konstruerade hjärt- och skelettmuskelvävnader och beskriver deras användning i prekliniska läkemedelsscreeningsmetoder. De beskrivna metoderna använder ett magnetiskt avkänningssystem för att underlätta samtidig bedömning av 24 vävnader parallellt.
Noggrann modellering av friska och sjukdomstillstånd in vitro är avgörande för utvecklingen av nya behandlingsstrategier och terapier. För hjärt- och skelettmuskelsjukdomar utgör kontraktil kraft och kinetik nyckeltal för att bedöma muskelfunktion. Nya och förbättrade metoder för att generera konstruerade muskelvävnader (EMT) från inducerade pluripotenta stamceller har gjort in vitro-sjukdomsmodellering mer tillförlitlig för kontraktila vävnader; Att reproducerbart tillverka vävnader från suspenderade cellkulturer och mäta deras kontraktilitet är dock utmanande. Sådana tekniker plågas ofta av höga felfrekvenser och kräver komplex instrumentering och anpassade dataanalysrutiner. En ny plattform och enhet som använder 3D EMT i kombination med en etikettfri, mycket parallell och automatiseringsvänlig kontraktilitetsanalys kringgår många av dessa hinder. Plattformen möjliggör enkel och reproducerbar tillverkning av 3D EMT med praktiskt taget vilken cellkälla som helst. Vävnadens kontraktilitet mäts sedan via ett instrument som samtidigt mäter 24 vävnader utan behov av komplexa mjukvaruanalysrutiner. Instrumentet kan på ett tillförlitligt sätt mäta mikronewtonförändringar i kraft, vilket möjliggör dosberoende screening av föreningar för att mäta effekten av ett läkemedel eller terapeutiskt på kontraktil utgång. Konstruerade vävnader tillverkade med denna enhet är fullt funktionella, genererar ryckningar och tetaniska sammandragningar vid elektrisk stimulering och kan analyseras i längdriktningen i odling under veckor eller månader. Här visar vi data från hjärtmuskel-EMT under akut och kronisk dosering med kända toxiska ämnen, inklusive ett läkemedel (BMS-986094) som drogs från kliniska prövningar efter patientdödsfall på grund av oförutsedd kardiotoxicitet. Förändrad skelettmuskelfunktion i konstruerade vävnader som svar på behandling med en myosinhämmare presenteras också. Denna plattform gör det möjligt för forskaren att integrera komplexa, informationsrika biotekniska modellsystem i sitt arbetsflöde för läkemedelsupptäckt med minimal ytterligare utbildning eller färdigheter som krävs.
Inducerade pluripotenta stamcellsmodeller (iPSC) blir alltmer nyckelaktörer i den prekliniska pipelinen för terapeutisk upptäckt och utveckling, liksom grundläggande biologisk forskning och sjukdomsmodellering 1,2,3,4,5. Kontraktila vävnader, såsom hjärt- och skelettmuskulatur härrörande från iPSCs, har stor potential att förbättra den prediktiva kraften hos humana in vitro-studier eftersom direkt bedömning av muskelkontraktil kraft och kinetik är kvantitativa mått för att studera övergripande vävnadsfunktion 4,6,7,8. Vanligtvis har mätningar av kontraktil kraft erhållits antingen indirekt genom optisk spårning av substratböjning 9,10 eller direkt genom bindning av celler/vävnader till en kraftgivare4,11,12. Dessa metoder, även om de är korrekta, är i sig låga genomströmningar och kräver vanligtvis högkvalificerade operatörer för att samla in och analysera data.
Tidigare arbete har visat att magnetfältsavkänning kringgår dessa hinder och ger en alternativ metod för att bedöma konstruerad muskelfunktion samtidigt över flera vävnadskonstruktioner13. Mantarray (Magnetometric Analyzer for eNgineered Tissue ARRAY) 3D Contractility Platform bygger på denna teknik med hjälp av en enhet som kan mäta kontraktiliteten hos konstruerade muskelvävnader på ett mycket parallellt sätt som utnyttjar komplexiteten hos 3D-cellulära modeller med screening med högre genomströmning14. Plattformen möjliggör etikettfri, kvantitativ realtidsövervakning av kontraktil funktion i hjärt- och skelettmuskelvävnader i eller utanför en standardcellodlingsinkubator, vilket eliminerar behovet av optisk baserad kontraktil avbildning och analys. Denna teknik underlättar direkt jämförelse av friska och sjuka cellinjer och möjliggör mätning av ett läkemedels effekt på kontraktila vävnader, vilket fastställer kvantifierbara, in vitro-, säkerhets- och effektdata för nya och befintliga terapeutiska föreningar.
Konstruerade 3D-muskelvävnader kan tillverkas mellan två stolpar på ett mycket reproducerbart sätt med hjälp av Mantarrays förbrukningsplatta med 24 brunnar (figur 1). En stolpe är styv, medan den andra stolpen är flexibel och innehåller en liten magnet. När vävnadskonstruktionen kontraherar förskjuter den den flexibla stolpen och den inbäddade magneten. EMT-plattan är placerad i instrumentet, och postförskjutning mäts via en rad magnetiska sensorer på ett kretskort under platthållaren. De uppmätta förändringarna i magnetfältet omvandlas till absolut kontraktil kraft med hjälp av en matematisk algoritm. Instrumentet använder snabba dataprovtagningsfrekvenser för att möjliggöra insamling av detaljerad information om funktionell kapacitet och mognad hos celltyperna som analyseras, inklusive kontraktionsfrekvens, hastighet och sönderfallstid. Dessa funktionella mätningar kan erhållas över alla 24 brunnar samtidigt med den magnetiska avkänningsplattformen eller individuellt och sekventiellt med traditionella optiska metoder.
Denna studie beskriver en mycket reproducerbar metod för att konstruera 3D-skelettmuskulatur- och hjärtmikrovävnader i en fibrinbaserad hydrogel. Under en kort 80-minuters reaktion katalyserar trombin omvandlingen av fibrinogen till fibrin, vilket ger en ställning för muskelceller att utvecklas i suspenderad kultur15. Stromaceller hjälper till att omforma matrisen och vävnader blir kontraktila när muskelceller bildar ett syncytium i hydrogelen. Kontraktiliteten hos dessa vävnader analyserades med hjälp av magnetisk avkänningsmetod, både före och efter substansexponering, vilket validerade denna modalitet för användning i dos-responsläkemedelsstudier. Primära humana myoblaster från en frisk donatorbiopsi erhölls kommersiellt och odlades i 2D enligt leverantörens protokoll. Celler expanderades med hjälp av ett skelettmuskeltillväxtmedium genom tre passager för att generera tillräckligt med cellnummer för att tillverka 3D-vävnader. Stromaceller och hiPSC-härledda kardiomyocyter odlades enligt leverantörens protokoll i 3 dagar för att möjliggöra återhämtning från kryokonservering innan celler gjuts i vävnader. Representativa resultat tillhandahålls som illustrerar de typer av dataset som kan samlas in med hjälp av magnetavkänningsplattformen. Vanliga fallgropar i samband med generering av konstruerade vävnader med hjälp av dessa metoder behandlas också.
Denna studie beskriver metoder för att generera 3D-konstruerade hjärt- och skelettmuskelvävnader i ett 24-brunns förbrukningsbart gjutningssats. Genom att följa dessa metoder är det möjligt att konsekvent uppnå en komplett uppsättning av 24 vävnader utan gjutningsfel för efterföljande läkemedelsscreening. Kritiska överväganden för att uppnå ett sådant resultat är att säkerställa att alla steg utförs på is under gjutning för att förhindra för tidig polymerisation av hydrogelerna, avlägsnande av celldissociationsreagens före vävnadsgjutning, grundlig blandning av cellen och hydrogelsuspensionen för varje vävnad, ersättning av pipettspetsar mellan vävnader och användning av värmeinaktiverad FBS (om den används alls). Det är också viktigt att se till att postgitteret inte flyttas när gjutningen börjar och överförs försiktigt när hydrogeler har bildats.
Stora modifieringar inkluderar användningen av olika celltyper för att uppnå hjärt- kontra skelett-EMT och dopning av hydrogeler med varierande koncentrationer av basalmembranproteiner för att främja cellulär mognad och vävnadsstabilitet. De gynnsamma effekterna av sådan dopning måste testas från fall till fall, men har visat sig förbättra funktionella resultat och vävnadslivslängd under vissa omständigheter14,16,22. Det är också anmärkningsvärt att de listade celldensiteterna är en guide och kan behöva optimeras för olika cellinjer. Alternativa hydrogelkompositioner kan också betraktas som ett sätt att modifiera de strukturella och funktionella egenskaperna hos de uppnådda EMT23,24,25. Den ursprungliga muskelmikromiljön innehåller också stödjande celltyper för att främja vaskularisering, innervation och matrisavsättning för att stödja myocyter i form och funktion26,27. Medan systemet som beskrivs här för närvarande innehåller fibroblaster i 3D-hjärtvävnader, kan ytterligare celltyper skapa en mer fysiologisk relevant modell för att studera säkerheten och effekten av terapeutiska föreningar in vitro. Tidigare har en rad stödjande celltyper framgångsrikt integrerats i 3D-konstruerade vävnader som presenterar en spännande mall för framtida studier med hjälp av magnetisk avkänningskontraktilitetsplattform28,29,30.
Felsökning för detta protokoll fokuserar på bildandet av opålitliga eller inkonsekventa vävnader under gjutningsprocessen. Försiktighet måste vidtas för att undvika bubbelbildning i hydrogelerna när de gjuts samtidigt som man underlättar jämn fördelning av cellerna under blandning. Optimeringsexperiment kommer sannolikt att behövas för varje ny celltyp för att identifiera ideala celldensiteter, cellförhållanden och matrissammansättning.
En stor begränsning för denna teknik är det betydande antalet celler som krävs för att etablera en hel platta med 24 EMT. För de data som presenteras här användes 15 miljoner kardiomyocyter och 18 miljoner skelettmyoblaster per platta. Vissa forskare kanske inte har tillgång till så stora pooler av cellulärt material, vilket kan hämma deras förmåga att använda denna plattform i sin fulla utsträckning. Om slutanvändarna inte har tillgång till hårdvara för magnetisk avkänning måste mätningar av efterböjningar utföras optiskt, vilket avsevärt minskar genomströmningen och förhindrar samtidig registrering av muskelsammandragningar över flera brunnar. Mantarray-hårdvaran övervinner dock dessa begränsningar för att erbjuda det första kommersiella systemet som kan kontinuerlig, icke-invasiv analys av EMT-kontraktion samtidigt över flera konstruktioner.
Magnetisk avkänning över 24 brunnar underlättar longitudinella studier av EMT-funktionell utveckling i realtid och möjliggör noggrann mätning av akuta svar på kemisk, miljömässig eller genetisk manipulation. Medan magnetisk avkänning har flera fördelar som samtidig mätning över flera vävnader och inte kräver komplicerad dataanalys, möjliggör optiska detektionsmetoder samtidig mätning av fysiologiska mätvärden som kalciumflöde eller spänningskartläggning. Datauppsättningar som de som illustreras i resultatavsnittet visar dock bredden av applikationer som denna teknik har inom läkemedelsutvecklingsområdet. Med tanke på att få analyser på marknaden erbjuder medel för att utföra en direkt bedömning av kontraktil produktion i konstruerad muskel, har dessa metoder potential att revolutionera den prekliniska utvecklingspipelinen.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis av finansiering från Food and Drug Administration (U01 FD006676-01 tilldelad Health and Environmental Sciences Institute) och genom finansiering från National Institutes of Health (HL151094 till Dr. Geisse). Vi tackar Dr. Alec S. T. Smith för hans hjälp med utarbetandet av detta manuskript.
100 µm cell strainer | CELLTREAT | 229485 | |
100 mm cell culture dish | ThermoFisher | 150466 | |
50 mL Steriflip filter | MilliporeSigma | SCGP00525 | |
500 mL filter flask | MilliporeSigma | S2GVU05RE | |
6-aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
B27 | Gibco | 17504044 | |
Cardiosight Maintenance Medium | NEXEL | CM-002A | |
Cardiosight Plating Medium | NEXEL | CM-020A | |
C-Pace EM stimulator | IonOptix | EM | |
Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit | Primary – DIFF | ||
Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit | Curi Bio | Primary – MAINT | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX | Gibco | 10566-016 | |
Dnase | Sigma | 11284932001 | |
DPBS | Gibco | 14190-250 | |
Dystrophin antibody | Abcam | ab154168 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | 10082147 | Must be heat-inactivated |
Fibrinogen (Bovine) | Sigma | E8630 | |
Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
Ham's F10 | Gibco | 11550043 | |
Hemacytometer | Sigma | Z359629 | |
HS-27A Fibroblasts | ATCC | CRL-2496 | |
Human Skeletal Muscle Myoblasts | Lonza | CC-2580 | |
Luer Lock 0.2 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
Luer Lock 10 mL syringe | BH Supplies | BH10LL | |
Mantarray Instrument | Curi Bio | MANTA-24-B1 | System |
Mantarray Plate Kits | Curi Bio | MA-24-SKM-5 | Pack of 5 kits |
Mantarray stimulation lid | Curi Bio | EM | |
Matrigel (ECM) | Corning | 356231 | |
Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
Optical Microscope | Nikon Ti2E | MEA54000 | |
Pan Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF-20 | |
Poly(ethyleneimine) | Sigma | P3143 | |
ROCK inhibitor | StemCell Technologies | Y-27632 | |
RPMI | Gibco | 11875-093 | |
Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2) | Lonza | CC-3245 | |
Standard 24-well plates | Greiner | M8812 | Other manufacturer's plates will not fit |
Standard 6-well plates | ThermoFisher | 140675 | |
Stromal medium (DMEM + 20% FBS) | |||
T175 Filter Flask | ThermoFisher | 159910 | |
T225 Filter Flask | ThermoFisher | 159934 | |
Thrombin | Sigma | T4648 | |
Trypan Blue solution, 0.4% | ThermoFisher | 15250061 | |
TrypLE Select Enzyme (10x) | Thermo Scientific | A1217702 | |
TrypLE Select Enzyme (1x) | Thermo Scientific | 12563011 |