חילוץ, תיוג וטיהור של תאים ספציפיים לשושלת מזקיקים אנטראליים אנושיים
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקולים לזיהוי וטיהור תאי שחלה מזקיקים אנטראליים. אנו מרחיבים שיטות לעיבוד שחלות שלמות לשימור בהקפאה של רצועות קליפת המוח תוך קצירת זקיקים אנטראליים שלמים המטופלים באופן אנזימטי כדי לשחרר סוגים רבים של תאים שוכנים זקיקים, כולל גרנולוסה, תיקה, אנדותל, המטופויטים ותאי סטרומה.
Abstract
ההפעלה, הצמיחה, ההתפתחות וההבשלה של הביציות הוא תהליך מורכב המתואם לא רק בין סוגי תאים מרובים של השחלה, אלא גם על פני נקודות בקרה מרובות בתוך מעגל ההיפותלמוס/יותרת המוח/השחלות. בתוך השחלה, מספר סוגי תאים מיוחדים גדלים בקשר הדוק עם הביצית בתוך זקיקי השחלות. הביולוגיה של תאים אלה תוארה היטב בשלבים מאוחרים יותר, כאשר הם מתאוששים בקלות כתוצרי לוואי של טיפולי פוריות בסיוע. עם זאת, ניתוח מעמיק של זקיקים אנטראליים קטנים שבודדו ישירות מהשחלה אינו מתבצע בדרך כלל בשל המחסור ברקמת שחלה אנושית והגישה המוגבלת לשחלה בחולות העוברות טיפולי פוריות בסיוע.
שיטות אלה לעיבוד שחלות שלמות להקפאה של רצועות קליפת המוח עם זיהוי/בידוד מקביל של תאים שוכנים בשחלות מאפשרות ניתוח ברזולוציה גבוהה של השלבים המוקדמים של התפתחות זקיק אנטראלי. אנו מדגימים פרוטוקולים לבידוד סוגי תאים בדידים על ידי טיפול בזקיקים אנטראליים באופן אנזימטי והפרדת תאי גרנולוסה, תקה, אנדותל, המטופויטים וסטרומה. בידוד התאים מהזקיקים האנטרליים בגדלים שונים ובשלבי התפתחות שונים מאפשר ניתוח מקיף של המנגנונים התאיים והמולקולריים המניעים את צמיחת הזקיקים ואת הפיזיולוגיה השחלתית ומספק מקור לתאים בני קיימא שניתן לגדל בתרבית במבחנה כדי לשחזר את מיקרו-סביבת הזקיק.
Introduction
המרכיבים הפונקציונליים העיקריים של השחלה האנושית הם הזקיקים, השולטים בצמיחה ופיתוח של ביציות. פרוטוקולים לבידוד תאים פוליקולריים נקבעו היטב בהקשר של הפריה חוץ גופית , אך אלה מתאימים רק לאיסוף תאים מזקיקים לוטאין בנקודת שאיבת הביציות1. פיתחנו פרוטוקול המאפשר בידוד אוכלוסיות תאים בדידות מזקיקים אנטראליים בשלבי התפתחות שונים הנובעים משחלות טבעיות או מרקמת שחלה מושתלת2. למרות שקיים קונצנזוס כי תרומתם של תאים שושבי זקיקים לטיפוח הביצית חשובה ביותר, מחקרים מעטים זיהו וחילצו באופן פרוספקטיבי את תת-הסוגים הפנוטיפיים הייחודיים הקיימים בזקיקים בשלב האנטראלי. הבנה מעמיקה יותר של היררכיית ההתמיינות והעברת האותות בין תאים מתמחים בשלבי ההתפתחות השונים עשויה להרחיב את הבנתנו את הפיזיולוגיה של השחלות בתנאים הומיאוסטטיים ופתולוגיים. יתר על כן, ההבחנה בין תת-סוגים תאיים בדידים ותרומתם המולקולרית לגדילה/הבשלה של זקיקים עשויה לספק אמצעי ליצירת פונדקאיות ex vivo המשחזרות את תפקוד השחלות כדי לעודד הבשלת ביציות ו / או לטפל בתפקוד אנדוקריני.
כל סוג תא ייחודי בתוך השחלה תורם לתפקוד המורכב של הזקיק, המתפקד למעשה כמיני-איבר נפרד לטיפוח הצמיחה וההבשלה של הביצית שהוא מכיל. הביצית, החלק המרכזי של הזקיק, עטופה ישירות בשכבה רציפה של תאי גרנולוזה (GCs), כאשר תאי התקה (TC) יוצרים שכבה משנית של תאים המשתלבים עם הביצית וה-GCs כדי להרכיב את היחידה הפוליקולרית. למרות שהם מסווגים לשתי קבוצות, GCs ו- TCs מכילים תת-סוגים רבים. GCs מסווגים לפי מיקומם בתוך הזקיק; GCs המקיפים את הביצית לעומת אלה הסמוכים לקרום המרתף מוגדרים כ- GCs oophorous ו- mural בהתאמה, ותתי סוגים אלה מציגים חתימות שעתוק ייחודיות. ל-TCs יש תת-סוגים רבים שתפקידם לספק תמיכה סטרואידוגנית, מטבולית ומבנית. תאי אנדותל, כלי דם ומערכת החיסון ממלאים תפקיד מרכזי בשמירה על פיזיולוגיה תקינה של השחלות. סטרומה השחלתית משמשת לא רק כמצע לצמיחת זקיקים, אלא גם ככל הנראה מספקת מקור לאבות המולידים TC. קומפלקס רב-שכבתי זה של תת-סוגים תאיים בתוך השחלה הוא המאפשר את תפקודה הן כאיבר אנדוקריני והן כאיבר רבייה.
מאמר זה מציג פרוטוקול לזיהוי וטיהור של גרנולוסה, תיקה, סטרומה, אנדותל ותאים המטופויטיים מזקיקים אנטראליים. השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לבודד את תאי השחלות הללו ולנתח אותם באמצעות ריצוף של תא בודד, ולאחר מכן צביעה ספציפית בזקיקים בשלבי התפתחות שונים. הפרוטוקול מספק מתודולוגיה פשוטה הניתנת לשכפול ותאפשר ניתוח ברזולוציה גבוהה הן של הפיזיולוגיה והן של הפתולוגיה של השחלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פתרון טוב יותר של המגוון התאי בתוך זקיקי השחלות חשוב מבחינה קלינית מכמה סיבות. ביישום הפרוטוקול הנ”ל על בידוד תת-הסוגים הפנוטיפיים הייחודיים השוכנים בתוך זקיקי השלב האנטראלי יש לקחת בחשבון מספר גורמים. ראשית, בריאותה וכדאיותה של רקמת השחלה שממנה נגזר הזקיק האנטרלי היא קריטית לקביעת איכות…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים על תמיכתם של Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (D.J.) ופרס Hung-Ching Liu Research Scholar Award (L.M). N.L.G נתמכת על ידי מענק ההשתלמות לפוסט-דוקטורט של NYSTEM Stem Cell and Regenerative Medicine.
Materials
| Chemicals, reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Anti-Anti |
| Antifade Mountant solution | Thermo Fisher Scientific | P36930 | ProLong Gold |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C 2674 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dispase II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D 2650 | Dimethyl sulfoxide |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Enzyme Cell Detachment Medium | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | Accutase |
| Fetal Bovine Serum, heat-inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10438026 | |
| Hanks′ Balanced Salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no phenol red |
| Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Normal Saline | Quality Biological | 114-055-101 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S 1888 | |
| Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter) | |||
| – 69.64 mL of Leibovitz's L-15 | |||
| – 17.66 mL of fetal bovine serum | |||
| – 3.42 g of sucrose | |||
| – 10.65 mL of DMSO | |||
| – 1 mL of antibiotic-antimycotic | |||
| Lab Plasticware and Supplies | |||
| 6-well Clear Flat Bottom Not Treated | Corning | 351146 | Falcon |
| Cell Strainer 100 µm | Fisher scientific | 352360 | Corning, Falcon |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 377267 | CryoTube 1.8 mL |
| Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm | Millipore Sigma | CLS430599 | 60EA |
| Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Fisher scientific | 352235 | Corning, Falcon |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm | Corning | 431154 | |
| Antibodies | |||
| ANPEP | BioLegend | 301703 | |
| CD34 | R&D Systems | FAB7227A | |
| CD45 | BioLegend | 304019 | |
| CD55 | BioLegend | 311306 | |
| CD 99 | BioLegend | 371308 | |
| PVRL | BioLegend | 340404 | |
| Surgical tools | |||
| long forceps (~150 mm length) | Fisherbrand | 12-000-128 | Fisher Scientific |
| medium forceps (~110 mm length) | Fisherbrand | 12-000-157 | Fisher Scientific |
| number 21 scalpel | Andwin Scientific | EF7281H | Fisher Scientific |
| number 11 scalpel | Andwin Scientific | FH/CX7281A | Fisher Scientific |
| sharp fine curved scissors | Roboz Surgical | RS-5881 | |
| Instruments | |||
| FACSJazz Flourescence activated cell sorter | BD | ||
| LSM 710 META Confocal microscope | Zeiss |
References
- Aghadavod, E., et al. Isolation of granulosa cells from follicular fluid; Applications in biomedical and molecular biology experiments. Advanced Biomedical Research. 4, 250 (2015).
- Man, L., et al. Comparison of human antral follicles of xenograft versus ovarian origin reveals disparate molecular signatures. Cell Reports. 32 (6), 108027 (2020).
- Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation. Human Reproduction. 18 (12), 2654-2659 (2003).
- Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
- Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Human Reproduction. 11 (7), 1487-1491 (1996).
- Man, L., et al. Chronic superphysiologic AMH promotes premature luteinization of antral follicles in human ovarian xenografts. Science Advances. 8 (9), 7315 (2022).
- Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
- Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocr Rev. 39 (1), 1-20 (2018).
- Asiabi, P., Dolmans, M. M., Ambroise, J., Camboni, A., Amorim, C. A. In vitro differentiation of theca cells from ovarian cells isolated from postmenopausal women. Human Reproduction. 35 (12), 2793-2807 (2020).
- Dalman, A., Totonchi, M., Valojerdi, M. R. Establishment and characterization of human theca stem cells and their differentiation into theca progenitor cells. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (12), 9853-9865 (2018).
