Caractérisation d’une souche pathogène d’Escherichia coli dérivée d’Oreochromis spp. Fermes utilisant le séquençage du génome entier

Summary

La faisabilité de stratégies de séquençage du génome entier (SGE) à l’aide d’instruments de paillasse a simplifié l’interrogation du génome de chaque microbe pertinent pour la santé publique en laboratoire. Une adaptation méthodologique du flux de travail pour le séquençage bactérien est décrite et un pipeline bioinformatique pour l’analyse est également présenté.

Abstract

L’aquaculture est l’un des secteurs de production alimentaire à la croissance la plus rapide au monde et l’élevage du tilapia (Oreochromis spp.) constitue la principale variété de poissons d’eau douce cultivée. Étant donné que les pratiques aquacoles sont sensibles à la contamination microbienne provenant de sources anthropiques, l’utilisation intensive d’antibiotiques est nécessaire, ce qui fait que les systèmes aquacoles deviennent une source importante de bactéries résistantes aux antibiotiques et pathogènes d’importance clinique, telles que Escherichia coli (E. coli). Ici, la résistance aux antimicrobiens, la virulence et les caractéristiques de mobilome d’une souche pathogène d’E. coli , récupérée chez Oreochromis spp. d’élevage intérieur, ont été élucidées par séquençage du génome entier (WGS) et analyse in silico . Des tests de sensibilité aux antimicrobiens (AST) et un séquençage pangénomique ont été effectués. De plus, le groupe phylogénétique, le sérotype, le typage de séquences multilocus (MLST), la résistance acquise aux antimicrobiens, la virulence, le plasmide et le contenu en prophages ont été déterminés à l’aide de divers outils Web disponibles. L’isolat d’E. coli ne présentait qu’une sensibilité intermédiaire à l’ampicilline et a été caractérisé comme étant la souche ONT:H21-B1-ST40 par typage à base de WGS. Bien qu’un seul gène lié à la résistance aux antimicrobiens ait été détecté [mdf(A)], plusieurs gènes associés à la virulence (VAG) du pathotype atypique E. coli entéropathogène (aEPEC) ont été identifiés . De plus, la cargaison de réplicons plasmidiques provenant de grands groupes plasmidiques et de 18 régions associées aux prophages a été détectée. En conclusion, la caractérisation WGS d’un isolat d’aEPEC, récupéré dans une ferme piscicole à Sinaloa, au Mexique, permet de mieux comprendre son potentiel pathogène et le risque possible pour la santé humaine de la consommation de produits aquacoles crus. Il est nécessaire d’exploiter les techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS) pour étudier les micro-organismes environnementaux et d’adopter un cadre « Une seule santé » pour apprendre comment les problèmes de santé apparaissent.

Introduction

L’aquaculture est l’un des secteurs de production alimentaire à la croissance la plus rapide au monde, et ses pratiques de production visent à satisfaire la demande alimentaire croissante pour la consommation humaine. La production aquacole mondiale a triplé, passant de 34 millions de tonnes (Mt) en 1997 à 112 Mt en 2017¹. Les principaux groupes d’espèces, contribuant à près de 75% de la production, étaient les algues, les carpes, les bivalves, les poissons-chats et les tilapias (Oreochromis spp.) ¹. Cependant, l’apparition de maladies causées par des entités microbiennes est inévitable en raison de la piscicult....

Protocol

REMARQUE : La souche ACM5 d’E. coli a été récupérée par traitement et culture de l’échantillon de poisson pour la détermination des coliformes fécaux (FC)¹². Au cours de l’échantillonnage des poissons, les poissons n’ont pas présenté de signes cliniques de maladie, d’infection bactérienne ou fongique, et une température moyenne de 22,3 °C a prévalu. Après isolement, l’isolat d’E. coli a été soumis à des tests biochimiques et cryoconservé dans un bouillon de perfusion cœur cérébral (BHI) avec du DMSO (8% v/v) comme agent cryoprotecteur.

1. Réactivation de la culture mère congelée d’E. coli<....

Results

La sensibilité aux antimicrobiens a été déterminée par la méthode de diffusion du disque et interprétée par les critères de seuil CLSI pour 12 antibiotiques couvrant six classes antimicrobiennes distinctes, c’est-à-dire les aminoglycosides, les β-lactamines, les fluoroquinolones, les nitrofuranes, les phénicols et les antagonistes des voies folates. L’ACM5 d’E. coli a montré une sensibilité à tous les antibiotiques, sauf un médicament β-lactamines. Quatre médicaments à base de β-lactamines ont été testés : ampic.......

Discussion

Cette étude présente une adaptation du flux de travail du séquenceur bactérien WGS à l’aide d’un séquenceur de paillasse et d’un pipeline pour la caractérisation génomique d’une variante pathogène d’E. coli. Selon la plateforme de séquençage utilisée, les délais d’exécution (TATs) pour les procédures de laboratoire humide (culture bactérienne, extraction d’ADNg, préparation de la bibliothèque et séquençage) et l’analyse de séquence peuvent varier, en particulier si des bactéries à croissance lente sont étudiées........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accublock Mini bain sec numérique	Labnet	D0100	Bain sec pour l’incubation de tubes
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	Perles magnétiques en solution pour la purification de la bibliothèque d’ADN
DeNovix DS-11	DeNovix Inc.		Spectophotomètre UV-Vis pour vérifier la qualité de l’ADN extrait
Tubes LoBind	Eppendorf	0030108418	1,5 mL Tubes PCR pour la mise en commun de banques d’ADN
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	12321D	Rack de microtubes magnétiques utilisé lors de la purification de l’ADN à base de billes magnétiques
Multibac I.D.	Recherche diagnostique (Mexique)	PT-35	Disques antibiotiques standard commerciaux pour les tests de sensibilité aux antimicrobiens
Kit de sortie intermédiaire MiniSeq (300 cycles)	Illumina	FC-420-1004	Cartouche de réactifs pour le séquençage des extrémités appariées (2x150)
MiniSeq System Instrument	Illumina	SY-420-1001	Séquenceur de paillasse utilisé pour la centrifugeuse de séquençage MiniSpin de nouvelle génération
	Eppendorf	5452000816	Centrifugeuse standard pour tubes
Nextera XT Kit de préparation de bibliothèque d’ADN	Illumina	FC-131-1024	Réactifs pour effectuer des banques d’ADN pour le séquençage. Comprend des réactifs de boîte 1 et de boîte 2 pour 24 échantillons
Nextera XT Index Kit v2	Illumina	FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004	Jeu d’indices A, B, C, D
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001	Contrôle de la bibliothèque d’ADN pour le séquençage Bain d’eau
de précision	LabCare America	51221081	Agitateur à bain d’eau utilisé pour la culture bactérienne
Qubit 1X dsDNA HS Kit	de dosageInvitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q33231	Réactifs pour le dosage de la quantification de l’ADN basé sur la fluorescence
Fluorimètre Qubit 2.0	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q32866	Fluorimètre utilisé pour le dosage de la fluorescence  ;
Tubes de dosage	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q32856	Tubes PCR de 0,5 mL pour le dosage de l’ADN basé sur la fluorescence
Thermocycleur SimpliAmp	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific	A24811	Thermocycleur utilisé pour l’amplification de banques d’ADN
Spectronic GENESYS 10 Vis	Thermo	335900	Spectophotomètre utilisé pour la suspension bactérienne dans les tests de sensibilité aux antimicrobiens
ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit	Zymo Research Inc.	D4300	Kit pour l’extraction de l’ADN génomique (50 préparations)